佘婷婷 吴映明 生书晶 骆 敏 严雪群

（广东第二师范学院生物与食品工程学院，广东广州510303）

金针菇（Flammulina velutipes）是一种著名的食药用真菌，具有“一高二低三丰富”的特点，所特有的真菌多糖具有良好的防癌和抗癌功效，能够显著的改善人体免疫机能和提高人体免疫力[1-3]，非常符合现代人的保健需求，备受消费者的亲睐，因而消费量也不断提高[4]。随着现代工业的迅猛发展，Hg污染问题已日益严重，食用菌通过栽培料对重金属离子具有一定的富集或生物转化作用，经常食用可通过食物链进入人体，从而影响食用者的健康[5]。水杨酸（SA）是一种广泛存在于植物体内的小分子酚类物质，对植物生长代谢具有广泛的调节作用，是一种高效的、廉价的、无毒的植物生长调节剂。前人研究表明SA能诱导植物重金属抗性、缓解重金属元素对于许多作物生长的胁迫作用[6]，但关于SA能否提高金针菇菌丝抗逆性却未见报道。研究在于为中度汞污染下金针菇培养的原位修复及寻找既能满足人类对食用菌的需求又能消除重金属对人类健康的危害的问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株白金针菇，编号GIM5.50，由广东省微生物菌种保藏中心提供。

1.2 试剂与仪器设备①试剂：氯化汞（分析纯，泰兴市化学试剂厂），水杨酸（分析纯，广州化学试剂厂），愈创木酚（分析纯，阿拉丁），羧甲基纤维素酶（分析纯，阿拉丁），葡萄糖（分析纯，阿拉丁），牛血清蛋白质（分析纯，阿拉丁）；②仪器设备：CHA-S恒温振荡器（常州澳华仪器有限公司），TDL-60B离心机（上海安亭科学仪器厂），DNM-9602A酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司），756MC型分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司），DDS-11A电导率仪（上海仪电科学仪器股份有限公司），pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 培养方法

1.3.1.1 制备培养基[7]PDA培养基：马铃薯20%，琼脂1.5%，葡萄糖2%；液体培养基：马铃薯20%，蛋白胨0.2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，维生素B10.002%，葡萄糖2%。

1.3.1.2 菌种活化 挑取菌株接种于PDA平板培养基上培养14 d。

1.3.1.3 SA调控处理方法 在液体培养基中加入HgCl 1 mg/L，SA试验设计1、10、20、50、100 mg/L和200 mg/L 6个水平，以不添加SA的液体培养基CK为对照。使用250 mL的锥形瓶装液50 mL，取1 cm2的菌种接到各培养液中，25℃，150 r/min的摇床振荡培养。

1.3.2 样品制备 接种后3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d各取3个重复样品培养液，过滤经4000 r/min离心机离心15 min上清液即为粗酶液。取少量粗酶液沸水煮10 min，冷却为空白对照。

1.4 胞外酶活力测定方法测定方法包括：淀粉酶活力测定[8]；愈创木酚氧化酶活性测定[9，10]；羧甲基纤维素酶（CMC酶）活性的测定[9]；漆酶活性的测定[12]采用ABTS法；蛋白质含量的测定[13]采用考马斯亮蓝染色法；还原糖的测定[13]。

1.5 pH与相对电导率的测定分别用pH计和电导率仪对培养液进行测定。

1.6 数据分析采用SPSS数据处理软件对试验数据进行差异显著性和方差分析。

2 结果与分析

2.1 SA对Hg胁迫下金针菇液体培养液中胞外淀粉酶活性的影响图1显示，SA能促进Hg胁迫下金针菇胞外淀粉酶活性，而且SA质量浓度越高与空白对照的差异越显著，SA质量浓度200 mg/L的酶活是所有处理中最高，随着培养时间的增长，淀粉酶活性先增后减，基本在接种后12 d时活性达到最高；SA低质量浓度（10 mg/L、20 mg/L）处理组均出现小高峰，这与杨晖[8]研究的低质量浓度的水杨酸能促进镉胁迫下香菇菌丝液体胞外酶活性影响是一致的。

图1 SA对Hg胁迫下金针菇胞外淀粉酶活性的影响

图2 SA对Hg胁迫下金针菇胞外愈创木酚酶活性的影响

2.2 SA对Hg胁迫下金针菇液体培养液中胞外愈创木酚酶活性的影响图2可见，金针菇胞外愈创木酚酶活性各处理组峰值分别出现在12～15 d。高质量浓度SA（≥50 mg/L）对酶活的促进作用最为显著，50 mg/L处理组酶活性最强，在接种后第12天时出现活力数值8.5 U/mL，低质量浓度SA处理组，酶活力基本都低于空白组；胞外愈创木酚酶活性，各组在第12天出现了峰值。王宜磊等[14]研究表明彩绒革盖菌在PDY液体培养基中的愈创木酚氧化酶活性第16天高峰有所差异，这也说明不同菌种生长特性各不相同、不同的菌种的愈创木酚氧化酶活时间存在着一定的差异。

2.3 SA对Hg胁迫下金针菇液体培养液中胞外羧甲基纤维素酶（CMC酶）活性的影响CMC酶与金针菇菌丝体对纤维素物质的利用有关，图3显示在各处理组CMC酶活分别于接种9～12 d出现了峰值。以SA为20 mg/L在接种12 d时的酶活最高（4.61 U/L）；SA为10、50、100 mg/L处理组也表现了较高的酶活性；而1、200 mg/L SA处理组显著低于对照组。低质量浓度SA（≤50 mg/L）处理组的酶活性均高于对照组，能提高Hg胁迫下金针菇胞外CMC的酶活，其中以20 mg/L SA处理组促进金针菇胞外CMC的诱导最为显著。

图3 SA对Hg胁迫下金针菇胞外羧甲基纤维素酶活性的影响

图4 SA对Hg胁迫下金针菇胞外漆酶活性的影响

2.4 SA对Hg胁迫下金针菇液体培养液中胞外漆酶活性的影响漆酶属于多铜氧化酶家族中的一大类，在木质素代谢过程中起着重要的作用，酶活性变化和金针菇利用木质素类物质密切相关。图4可见，各组漆酶的酶活力均在12 d出现了峰值，其中以1 mg/L SA处理组的漆酶的酶活性最高（2.56 U/L），显著高于对照组和其他处理组，低质量浓度（≤20 mg/L）的SA显著提高Hg胁迫下金针菇胞外漆酶的活性，这与孙淑静[15]研究的酶活力峰值相近。

2.5 SA对Hg胁迫下金针菇液体培养液中蛋白质含量的变化粗酶液中的蛋白质主要为酶蛋白。蛋白质浓度的变化可以从总体上反映金针菇胞外酶系的变化过程，各种酶随着菌丝体适应环境而生长后在其调节机制下迅速生成，对应的蛋白质浓度也会相应增加。各处理组蛋白质质量浓度在接种后第6～12天出现峰值（图5），低浓度处理能显著提高汞胁迫下金针菇胞外蛋白含量，且以SA质量浓度为20 mg/L作用最为显著；SA质量浓度≥50 mg/L处理组的蛋白含量峰值出现在第6天，而对照组和低质量浓度的SA处理组（≤20 mg/L）的蛋白含量峰值出现在第9～12天，低质量浓度处理组要显著高于空白对照组，其中以20 mg/L，在接种第12天时胞外蛋白质含量最高（0.057 mg/L）。各处理组胞外蛋白的含量峰值与胞外酶活性最强时间基本同步。

2.6 SA对Hg胁迫下金针菇液体培养液中还原糖浓度的变化各个处理组还原糖质量浓度最低值出现在第6～9天，峰值出现在第15天，中高质量浓度SA（≥20 mg/L）处理组，还原糖均显著高于空白组；SA对Hg胁迫下金针菇各处理组的还原糖质量浓度呈现先下降后上升再下降的趋势。其原因可能与淀粉酶、CMC酶等在SA的作用下的活性增大有关，第18天随着各种酶活力的下降培养液中还原糖含量逐渐下降。这与曹春蕾等[16]研究的桑木层孔菌在第9天含量基本为零是一致的。随着培养时间的推移和生长速度的加快还原糖迅速降低。

2.7 SA对Hg胁迫下金针菇培养液相对电导率和pH变化情况培养过程中酶液的导电性越强，测定的电导率数值就越大，即表示菌液里溶解物就越多[17]。各处理组酶液的相对电导率波动在6980～14 600 s/m，其中以SA质量浓度为20 mg/L接种第12天时测得电导率数值最大；各处理组pH波动在4.8～5.9，高质量浓度SA处理组pH都比空白对照要低，20 mg/L处理组pH始终要比其他的处理组高，这与该浓度下各种酶活的强弱程度成正相关，与培养液里还原糖、蛋白质含量有直接关系，特别是蛋白质含量保持一致趋势。

图5 SA对Hg胁迫下金针菇培养液蛋白质含量变化的影响

图6 SA对Hg胁迫下金针菇培养过程中还原糖浓度的变化

图7 SA对Hg胁迫下金针菇培养液电导率的变化情况

图8 SA对Hg胁迫下金针菇培养过程中pH的变化

3 小结与展望

在Hg胁迫下SA对金针菇液体培养的胞外酶活性以及还原糖、蛋白质含量等影响起到重要作用，对胞外酶活性有促进作用并且峰值出现在第12～15天。外施SA能缓解Hg对植物的毒害，常云霞等[18]研究表明外施SA能缓解Hg胁迫对幼苗生长的抑制作用；杨晖等[8]研究表明，低质量浓度的SA能促进镉胁迫下香菇菌丝液体培养胞外酶活性。试验结果表明：中高质量浓度SA（≥50 mg/L）能显著地提高金针菇在Hg胁迫下胞外淀粉酶、愈创木酚酶，还原糖含量随着胞外酶的变化而变化；中低质量浓度SA（≤20 mg/L）能显著地提高胞外羧甲基纤维酶、漆酶的活性，相对电导率、pH和蛋白质含量均保持着较高的水平；中低质量浓度SA可以缓解重金属汞对金针菇菌丝的生长抑制作用，且以20 mg/L SA为最理想的缓解中度重金属对金针菇毒害的浓度。试验所采用电导法具有分析快速，操作简便，不消耗样品与试剂的优势，在植物研究方面电导法的运用已非常普遍且卓有成就，如植物抗寒性和耐热性比较等[17]，但在食用菌液体培养方面研究较少。水杨酸对锌、铬、镉等重金属污染下金针菇的生长影响也是有待研究；电导法和pH变化的进一步研究可以为食用菌液体培养研究注入新的方法。