唐静月颜美秋齐芳芳戴明珠王楠楠吕圭源陈素红,3

1.温州医科大学 浙江，温州 325035 2.浙江中医药大学 3.浙江工业大学

铁皮石斛花总黄酮提取工艺优化及体外抗氧化活性研究

唐静月1颜美秋2齐芳芳1戴明珠1王楠楠1吕圭源2陈素红1,3

1.温州医科大学 浙江，温州 325035 2.浙江中医药大学 3.浙江工业大学

[目的]确定铁皮石斛花中总黄酮超声辅助提取最佳工艺条件，并对其抗氧化活性进行评价。[方法]采用正交试验方法，以总黄酮提取率为考察指标，对铁皮石斛花总黄酮提取方法的影响因素进行探讨，并对铁皮石斛花总黄酮提取工艺进行优化。以羟自由基清除率、DPPH和ABTS自由基清除率为指标，对铁皮石斛花总黄酮的体外抗氧化活性进行评价。[结果]铁皮石斛花总黄酮的最佳提取条件：乙醇体积分数80%,料液比1:50,提取温度55℃,提取次数2次，在以上条件下，总黄酮提取率达1.99%。铁皮石斛花总黄酮对羟自由基、DPPH和ABTS自由基有较强的清除作用，且羟自由基抗氧化活性与总黄酮含量呈正相关。[结论]利用正交法分析结果可靠，得到了铁皮石斛花总黄酮超声提取的最佳工艺条件，且实验结果还表明铁皮石斛花具有较强的抗氧化活性。

铁皮石斛花；总黄酮；正交试验；提取工艺；抗氧化

铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛 Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥茎，具有益胃生津，滋阴清热之功效。《神农本草经》谓其：“味甘，平。主伤中，除痹，下气，补五脏虚劳羸瘦，强阴，久服厚肠胃”。现代药理学研究表明其具有抗氧化、降血糖、抗肝损伤、抗肿瘤等作用，对消化、心血管和免疫系统疾病有明显的治疗效果[1]。铁皮石斛的药用部位为茎，其花为非药用部位，目前也未被列入新食品原料。随着铁皮石斛人工种植技术的推广，种植面积的不断加大，铁皮石斛花产量较大，据统计，仅浙江省鲜花年产量就可达1500～3000吨，干花150～300吨，造成了极大的资源浪费。长期以来，铁皮石斛种植农户普遍以铁皮石斛花泡茶饮用，还常见榨汁、炒蛋、煲汤、特色烹饪等方式食用。民间传统认为其具有滋阴润肺、养胃生津、安神解郁的功效，未见有不良反应，具有良好的开发前景。前期研究发现[2-9]，铁皮石斛花含有大量的黄酮类化合物与有机酸类、萜类等资源性成分，这些成分具有较强的生物活性，能够有效的抗氧化、抗衰老、抗炎镇痛、调节免疫。本实验旨在优化铁皮石斛花的总黄酮提取工艺，探讨其抗氧化作用，为铁皮石斛花的开发利用提供实验依据，使铁皮石斛产品的功效和形式更为多样化，满足市场需求。

1 材料、试剂与仪器

1.1 材料 铁皮石斛花于2016年收集于浙江杭州、金华、台州、云南普洱6个铁皮石斛种植基地（编号为S1~S6），经鉴定为兰科植物铁皮石斛的花，留样凭证存放于浙江中医药大学药物研究所。

1.2 试剂 芦丁标准品购自中国药品生物制品检定所，批号：100080-200707；1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH) (上海源叶生物科技有限公司，批号:W09A7E12633)；2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐(ABTS)、L-抗坏血酸（Vitamin C）、水杨酸均购自上海生工生物工程股份有限公司，批号：C627BA0012、C927BA0042、C51213A0021；无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、硫酸亚铁、过氧化氢、过硫酸钾均为国产分析纯。

1.3 仪器 AG135电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；Lambda45紫外可见分光光度计（Perkin Elmer）；DGG-907013型电热恒温干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；KQ-500DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Power Wave 340酶联免疫检测仪(美国Bio-TeR公司)。

2 方法

2.1 铁皮石斛花总黄酮最佳提取工艺优化

2.1.1 单因素试验

2.1.1.1 提取方法对总黄酮提取率的影响 ①加热回流提取法：乙醇体积分数70%，料液比1:100（g·mL-1），80℃回流提取3次，每次1h；②超声提取法：乙醇体积分数70%，料液比1:100（g·mL-1），50℃超声提取3次，每次40min。探讨不同提取方法对总黄酮提取率的影响。

2.1.1.2 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响 固定料液比1:50（g·mL-1）、提取时间40min、提取温度70℃、提取次数1次，探讨乙醇体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）对总黄酮提取率的影响。

2.1.1.3 提取时间对总黄酮提取率的影响 固定乙醇的体积分数80%、提取温度70℃、料液比1:50（g· mL-1）、提取次数1次，探讨提取时间（20、30、40、50、60min）对总黄酮提取率的影响。

2.1.1.4 料液比对总黄酮提取率的影响 固定乙醇体积分数80%、提取时间40min、提取温度70℃、提取次数1次，探讨料液比（1:20、1:30、1:40、1:50、1:60g· mL-1）对总黄酮提取率的影响。

2.1.1.5 提取温度对总黄酮提取率的影响 固定乙醇体积分数80%、提取时间40min、料液比1:40（g· mL-1）、提取次数1次，探讨提取温度（45、55、65、75、85℃）对总黄酮提取率的影响。

2.1.1.6 提取次数对总黄酮提取率的影响 固定乙醇体积分数80%、提取时间40min、料液比1:40（g· mL-1）、提取温度55℃，探讨提取次数（1、2、3、4次）对总黄酮提取率的影响。

2.1.2 正交试验 根据单因素试验结果，确定以乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取温度(C)、提取次数(D)为试验因素进行正交设计，每因素3个水平(表1)，按照L9(34)正交表进行试验(表2)，优化铁皮石斛花总黄酮的提取工艺。

2.1.3 最佳提取工艺验证实验 精密称取铁皮石斛花粉末1.00g（平行3份），按“2.1.2”项下优化所得最佳提取工艺提取铁皮石斛花总黄酮，并计算总黄酮提取率。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test

2.2 铁皮石斛花总黄酮含量测定

2.2.1 芦丁标准溶液的制备 称取芦丁标准品10 mg，精密称定，以70%乙醇溶解后，置于50mL容量瓶中，用70%乙醇稀释定容至刻度，摇匀后得到质量浓度为0.2mg·mL-1的芦丁标准溶液。

2.2.2 最大吸收波长的确定 精确移取上述芦丁标准溶液3.0mL，供试品溶液1.0mL，各置于10mL具塞试管中，加70%乙醇溶液至5mL，加5%NaNO2溶液0.4mL，摇匀放置6min，加10%Al(NO3)3溶液0.4mL，摇匀，再放置6min，加4%NaOH溶液4mL，摇匀放置15min，以试剂空白作参比，于紫外可见光分光光度计上进行全波长扫描，测得最大吸收波长510nm。

2.2.3 芦丁标准曲线的绘制 精密吸取芦丁标准品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL分别置于10mL具塞试管中，各加70%乙醇溶液至5mL，按2.2.2项下法操作，在510nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线，得出芦丁标准曲线的线性回归方程。

2.2.4 总黄酮的含量测定 精确移取待测液 1.0 mL，按2.2.2项下法操作，代入标准曲线的线性回归方程计算总黄酮浓度，并以下式计算总黄酮的提取率：铁皮石斛花总黄酮提取率(%)＝

式中：C为标准曲线上得出的质量浓度(mg·mL-1)；V1为反应体积(mL)；V2为配制的溶液体积(mL)；v为取样体积(mL)；m为样品质量(g)。

2.3 铁皮石斛花总黄酮体外抗氧化活性测定

2.3.1 样品溶液的制备 分别准确称取6个不同产地2.00g铁皮石斛花粉末，按照最佳工艺条件提取，过滤定容至100mL，提取液减压浓缩至适量，真空干燥后得干浸膏，试验前用80%乙醇配成所需浓度。

2.3.2 清除DPPH自由基能力的测定 分别取不同浓度的样品溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg· mL-1）40μL，加入200μL 0.1mmol·L-1的DPPH无水乙醇溶液，室温避光反应30min，于517nm波长处测定吸光度(Ai)。以L-抗坏血酸作阳性对照，无水乙醇作为样品对照(Ac)，样品溶剂作为空白对照(Ao)，每份样品平行实验3次[10]。按照下列公式计算自由基清除率：DPPH自由基清除率(%)=[Ao-(Ai-Ac)]/Ao×100%。

2.3.3 清除羟自由基能力的测定 分别取不同浓度的样品溶液（2、4、6、8、10mg·mL-1）100μL，加入浓度为6.0mmol·L-1硫酸亚铁，10.0mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液各100μL，再加入6.0mmol·L-1H2O2溶液100μL，置37℃反应10min，于510nm波长处测定吸光度(Ai)。以L-抗坏血酸作阳性对照，蒸馏水作为样品对照(Ac)，样品溶剂作为空白对照(Ao)，每份样品平行实验3次。按照下列公式计算自由基清除率：羟自由基清除率(%)=[Ao-(Ai-Ac)]/Ao×100%。

2.3.4 清除ABTS自由基能力的测定 分别取不同浓度的样品溶液（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg·mL-1）50μL，加入200μL ABTS工作液[11]，室温避光放置6min，于734nm处测定吸光度(Ai)。以L-抗坏血酸作阳性对照，80%乙醇作为样品对照(Ac)，样品溶剂作为空白对照(Ao)，每份样品平行实验3次[10]。按照下列公式计算自由基清除率：ABTS自由基清除率(%)=[Ao-(Ai-Ac)]/Ao×100%。

2.4 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据结果以“平均值±标准差”（n=3）表示，采用Pearson相关系数对总黄酮含量与体外抗氧化活性进行相关性分析。

3 结果与分析

3.1 最大吸收波长的确定 进行200~700nm全波长扫描，芦丁标准品溶液与供试品溶液均在510nm处有最大吸收峰，故确定最大吸收波长为510nm。见图1，2。

图1 芦丁标准溶液的吸收光谱Fig.1 Absorption spectra of rutin standard

图2 样品溶液的吸收光谱Fig.2 Absorption spectra of sample solution

3.2 芦丁标准曲线的绘制 以芦丁作为标准品，510nm处测吸光度，以吸光度(y)为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，线性回归方程：y＝11.856x-0.0237，R2＝0.9988。结果表明，在芦丁质量浓度为0.0209～0.0834mg·mL-1范围内线性关系良好。

3.3 铁皮石斛花总黄酮的单因素试验

3.3.1 提取方法对总黄酮提取率的影响 实验结果表明：加热回流提取法总黄酮提取率为1.83%，超声波提取法提取率为1.99%，总黄酮提取率：超声波提取法＞加热回流提取法。

3.3.2 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响（图3）。结果表明：总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增大而升高，于乙醇体积分数80%时达到最高值，之后随着乙醇体积分数的增大而降低。

图3 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of total flavonoids

3.3.3 提取时间对总黄酮提取率的影响 提取时间对总黄酮得率的影响（图4）。结果表明：总黄酮提取率随时间的延长而升高，在提取时间为40min时达到最高值；之后随时间的延长总黄酮提取率下降。

图4 提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of extraction time on extraction efficiency of total flavonoids

3.3.4 料液比对总黄酮提取率的影响 料液比对总黄酮得率的影响（图5）。结果表明：总黄酮提取率随溶剂量的增大而升高，在料液比为1：40时达到最高值，之后开始降低。

图5 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.5 Effect of material-liquid ratio on extraction efficiency of total flavonoids

3.3.5 提取温度对总黄酮提取率的影响 提取温度对总黄酮提取率的影响（图6）。结果表明：总黄酮提取率随着提取温度的升高先上升后下降，在提取温度为55℃时达到最高值。

图6 提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction efficiency of total flavonoids

3.3.6 提取次数对总黄酮提取率的影响 提取次数对总黄酮得率的影响（图7）。结果表明：总黄酮提取率随着提取次数的增加而升高，2次后总黄酮提取率升高的趋势较平缓。

图7 提取次数对总黄酮提取率的影响Fig.7 Effect of extraction times on extraction efficiency of total flavonoids

表2 总黄酮提取工艺正交试验设计及结果Tab.2 Orthogonal array design matrix and results

表3 正交试验结果方差分析Tab.3 Variance analysis for the orthogonal array design experimental results

3.4 铁皮石斛花总黄酮的正交试验 选择乙醇体积分数、液料比、提取温度、提取次数等较优水平，按L9(34)设计正交试验(表2、3)。观察正交试验结果可知，铁皮石斛花总黄酮提取中各因素的主次顺序为：提取次数>乙醇体积分数>料液比>提取温度；由正交试验结果得出最优因素水平组合为A2B2C2D3。提取次数增大会增加生产成本，综合考虑，最优提取工艺组合为A2B2C2D3，即乙醇体积分数80%、料液比1:50、提取温度55℃、提取次数2次。

表4 不同样品中总黄酮含量（n=3）Tab.4 Contents of total flavonoids in extract of different samples（n=3）

3.5 验证实验 按正交试验确定的最优提取工艺组合条件，进行验证试验，得出平均总黄酮提取率为1.99%。

3.6 铁皮石斛花总黄酮含量测定 铁皮石斛花各样品中总黄酮的含量结果见表4。

3.7 铁皮石斛花总黄酮体外抗氧化活性测定

3.7.1 清除DPPH自由基能力的测定 结果如图8所示，样品对DPPH自由基的清除率呈现一定的浓度依赖性，清除率随浓度的增加而增加。IC50值见表5。

图8 样品液和Vc清除DPPH自由基的能力Fig.8 Free radical scavenging properties of extracts and Vc against DPPH

3.7.2 清除羟自由基能力的测定 结果如图9所示，样品对羟自由基的清除率随浓度的增加而增加，呈明显量效关系。IC50值见表5。

图9 样品液和Vc清除羟自由基的能力Fig.9 Free radical scavenging properties of extracts and Vc against ·OH radicals

3.7.3 清除ABTS自由基能力的测定 结果如图10所示，样品对ABTS自由基的清除率随浓度的增加而增加，呈明显量效关系。IC50值见表5。

图10 样品液和Vc清除ABTS自由基的能力Fig.10 Free radical scavenging properties of extracts and Vc against ABTS

表5 不同样品的抗氧化活性IC50Tab.5 IC50of different extracts for various antioxidant systems

3.7.4 总黄酮含量与抗氧化活性的相关性 对6批铁皮石斛花样品总黄酮含量与清除DPPH自由基能力、清除羟自由基能力和清除ABTS自由基能力进行Pearson法相关性分析，结果如表6所示，总黄酮含量与羟自由基清除能力有显著的相关性（P＜0.05），与DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力相关性较弱。

表6 总黄酮含量与抗氧化活性的相关性Tab.6 Correlations between the antioxidant activities and flavonoids content

4 结论

4.1 总黄酮提取工艺优化 本实验采用超声法提取铁皮石斛花中的黄酮，并通过单因素考察和正交设计，优化得到总黄酮得率最高的铁皮石斛花超声提取工艺。①单因素试验中总黄酮提取率超声波提取法大于加热回流提取法，结合后面的实验，其可能是因为回流提取温度为80℃时黄酮类物质结构不稳定而分解，溶出率低，故选择超声波提取法。②乙醇体积分数为80%时总黄酮提取率达到最高值，这可能与铁皮石斛花中总黄酮的溶解度有关。③提取温度55℃时总黄酮提取率最大，这种现象可能是因为升高温度增大了黄酮类物质的溶出速率，而当温度过高时黄酮类物质不稳定，结构被破坏，总黄酮得率有所降低。④在单因素考察的基础上，正交试验得出最佳工艺条件，经验证该工艺稳定，提取得到的铁皮石斛花醇提液中总黄酮含量高。

4.2 三个体外抗氧化体系活性评价 本实验以DPPH自由基、羟自由基和ABTS自由基的清除率为指标，从不同方面综合评价了铁皮石斛花体外抗氧化效果。实验结果表明，不同产地铁皮石斛花的80%醇提物对DPPH自由基、羟自由基和ABTS自由基均有清除作用，在一定的浓度范围内呈现线性关系，说明其有较好的抗氧化能力。研究显示[7-8,12-14]，铁皮石斛花中含多糖、黄酮、多酚等成分，均有一定的抗氧化活性。铁皮石斛花中黄酮类成分主要是芹菜素为苷元的黄酮二糖碳苷类化合物，周桂芬等[7]发现上述黄酮碳苷成分具有较强的DPPH自由基清除能力。

4.3 总黄酮含量测定及体外抗氧化活性相关性分析本实验进行了各不同来源铁皮石斛花总黄酮含量测定，并进一步分析了不同来源铁皮石斛花中黄酮含量与羟自由基、DPPH自由基和ABTS自由基清除能力之间的相关性，结果显示总黄酮含量与羟自由基清除能力有显著的相关性（P＜0.05），而与DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力相关性较弱。这表明上述两种自由基的清除能力可能不是与黄酮总量相关，而是与黄酮的具体组成及含量有关。铁皮石斛花中黄酮成分以及与清除DPPH、ABTS和羟自由基的关联性及构效关系有待进一步研究。

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Study on Optimum Extraction of Total Flavones in Dendrobium Officinale Flower and Its Antioxidant Activity in Vitro

TANG Jingyue1,YAN Meiqiu2, QI Fangfang1,et al 1.Wenzhou Medical College,Zhejiang(325035),China;2.Zhejiang Chinese Medical University

[Objective]To explore the optimal ultrasonic-assisted extraction conditions of total flavonoids from D-endrobium officinale flower and evaluate the antioxidant activity.[Methods]Orthogonal experiment was conducted to study the influence factor of extracting total flavones from Dendrobium officinale flower，the yield of total flavones as inspection index，and then optimized the extraction technology.The antioxidant effects of the total flavones were determined by hydroxyl,DPPH and ABTS radical scavenging capacities.[Results]The optimal extraction conditions of total flavonoids were ethanol concentration of 80%，material-liquid ratio of 1:50，extraction temperature of 55℃ and 2 extraction times.Under the optimal conditions，the maximum extraction rate of total flavonoids was 1.99%.Extracted total flavonoids had strong scavenging capacity on hydroxyl free radicals,DPPH and ABTS free radicals.[Conclusion]Orthogonal experiment is applicable for the optimization of ultrasonic extraction of total flavonoids from Dendrobium officinale flower. The total flavonoids from Dendrobium officinale flower have strong antioxidant capacity.

Dendrobium officinale flower;total flavonoids;orthogonal experiment;extraction;antioxidant activity

R282.71

A

1005-5509（2017）03-0235-08

10.16466/j.issn1005-5509.2017.03.017

2016-12-08）

国家自然科学基金（81673638）；国家“十二五”科技支撑计划（2011BA104B06）；浙江中医药大学校级课题（2015Z11；2016ZG16）

Fund projects:National Natural Science Foundation of China(81673638)；National Science&Technology Pillar Program during the Twelfth Five-year Plan Period(2011BA104B06)；Colonel-level topics supported by Zhejiang University of Chinese Medicine(2015Z11;2016ZG16)

陈素红，E-mail:chensuhong@aliyun.com