刘西梅　华再东　任红艳　肖红卫　李莉　华文君　张立苹　毕延震

摘要：比較了不同来源、不同状态组织和不同分离方法对猪成纤维细胞的影响，结果表明，离体组织长时间乙醇预处理和长时间储运会降低细胞活力，使生长速度减慢；初始原代细胞种类比较多，生长不均匀，只有传代培养3代以上，才能得到比较纯的成纤维细胞。

关键词：猪；成纤维细胞；分离；培养

中图分类号：R329-33 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）04-0702-02

随着生物技术的发展，原代成纤维细胞已经成为非常特殊的资源[1]。由于试验材料来源广、分离培养条件不苛刻，细胞的分裂增殖能力强，适应性好，且性状稳定[2，3]，同时又能模拟体内生长状况、生长环境简化、生长条件明确、施加实验因素方便、容易获得直接活体观察结果以及方便控制培养产物等特点[3，4]，所以成纤维细胞得以广泛地研究和应用。医学上用于疾病诊断、人工皮肤、组织创伤修复、组织器官培养[1，5]；动物上用于体细胞克隆、转基因[6，7]，以实现濒危畜禽保种及扩繁、优良品种的快速繁育、转基因新品种培育；基础研究上为遗传学、细胞学、胚胎学、组织学、免疫学等提供基础材料和分离培养模式[8]。因此，建立一种快速、实用、简便的猪成纤维细胞分离培养方法成为急需。本研究比较了不同来源、不同状态组织和不同分离方法对成纤维细胞的影响，旨在为相关研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器及试剂

35 d的胎猪、新生小猪、成年猪；超净工作台、超低温冰箱、CO2培养箱、眼科剪、培养瓶、离心管、血球计数板；乙醇、PBS溶液、DMEM培养基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，Hyclone公司）、中性蛋白酶、胰蛋白酶；青霉素、链霉素、台盼蓝、EDTA、DMSO。除了特别说明外，其他试剂均源于Sigma公司[1，7，9，10]。

1.2 试验方法

1.2.1 组织取样 通过手术，从怀孕35 d的湖北白猪母猪体内无菌取出胎儿，浸泡在PBS（100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL链霉素）中，室温尽快带回实验室无菌间，在超净工作台上，用镊子去除胎儿头、尾、四肢、心脏及其他脏器，用PBS清洗后，用眼科剪将胚胎剪碎成约1 mm的3小块，用PBS冲洗2次，再用相应的培养基洗1次，备用[9]；耳组织来自湖北白猪耳边沿皮肤（大、小猪均可），经剪毛、清洗、消毒、生理盐水再清洗后，在耳边沿无菌剪取多个皮肤约0.5 cm2，放入PBS（100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）中，室温2 h内运回实验室，在超净工作台上去除表皮及皮下组织，用PBS溶液洗涤2次， 将组织剪成约1 mm的3小块，用相应的培养基洗1次，备用[6]。

1.2.2 细胞培养 组织块培养是将组织块直接接种到培养皿上，或是将组织块用0.25%中性蛋白酶在4 ℃处理2～4 h，剩余组织块以1～2 mm间距接种于培养瓶内壁或培养皿上，加入少量DMEM培养液（含10%FBS），置于39 ℃的5%CO2培养箱中培养24 h，待组织块吸附牢固后，次日补加培养液至正常体积，3 d后换液[1]；如果是细胞培养，则向剪碎的组织块中加入约2倍组织块体积的37 ℃预温的0.25%胰酶（含0.04%EDTA），在4 ℃中消化12～16 h（期间有规律地摇晃3～4次），加入DMEM培养液（含10%FBS）终止消化；取上清液，以800 r/min离心5 min，弃上清液，然后加入培养液，轻轻吹打重新悬浮细胞，以5×104个/mL的密度接种于培养瓶或培养皿中[9]。

1.2.3 细胞传代 细胞在组织块周围生长成片时，或当培养的细胞达到85%～90%汇合度时传代。加入2 mL 0.25%胰蛋白酶和0.04% EDTA混和溶液（Gibco）消化细胞3～4 min（细胞边沿开始有收缩即可），加入2 mL细胞培养液终止消化，轻轻吹打让细胞悬浮，转入离心管，1 000 r/min离心5 min，用培养液重新悬浮细胞，计数后以5×104个/mL的密度接种于新培养瓶继续培养，经过5～7 d的生长后，细胞达到85%～90%汇合，再次按1∶3或1∶4比例进行传代培养。如此反复传代，可以进一步纯化成纤维细胞[6]。

2 结果与分析

2.1 组织块处理

组织细胞离开身体后非常脆弱，任何处理都会对细胞造成伤害，乙醇消毒、运输时间等会影响原代细胞的生长，其中乙醇长时间消毒对细胞的伤害最大，其次是运输时间。培养7 d后，细胞的生长状况见表1。

从表1中可以看出，乙醇短时间处理组织对细胞生长没有影响，而处理时间延长会使细胞生长减慢，但这种处理对活体组织没有影响，即在组织没有离开肌体前处理，不影响组织采集后细胞的生长。

由表2可见，运输时间1～2 h对细胞生长几乎没有影响，然而当运输时间达到4 h时细胞生长活力开始降低，6 h时已不适宜作为原代细胞分离培养。所以分离原代成纤维细胞时，取组织后应尽快运回实验室培养，这样可以提高成功率。

2.2 成纤维细胞的培养与分离

从组织中开始分离的原代细胞种类比较多，而且生长不均匀，无法判断成纤维细胞（图1，图2），只有传代培养3代以上，才能得到比较纯的成纤维细胞（图3，图4）。

培养7～8 d的组织块周围可见多边形细胞并向四周成片生长，培养13 d时传代培养，传代后细胞生长迅速，约6 d细胞即可长满培养板；消化法得到的细胞培养5 d，细胞开始向周围快速生长，大约培养11～12 d即可传代，传代后6 d细胞长满培养板[6]。

3 讨论

成纤维细胞是非常重要的供体细胞之一，无论是用组织块培养获得，还是用消化培养制备，均可获得比较纯的成纤维细胞。但前期处理会影响原代细胞的生长，特别是离体后，样品长时间储运会降低细胞的生长速度，乙醇长时间消毒处理直接抑制细胞的生长，样品离体前乙醇处理对细胞的生长影响较小。其原因可能是离体前处理，乙醇被血液及组织液稀释或带走，进入组织细胞的乙醇浓度不容易快速升高，对细胞活力影响小，而离体后组织细胞中的乙醇浓度很快达到峰植，直接影响了细胞的活力；离体组织长时间储运由于没有营养，细胞代谢受到影响，细胞活力有所降低，但影响较小。

组织块和消化法分离的细胞均可用于体细胞克隆，两者的差别在于分离细胞所用的时间长短不一，对于纯度要求不高的细胞而言，消化法比组织块法更快收获大量的1～2代细胞。其原因是原代培养时，消化法原始生长点比组织块法多很多，消化后每个细胞都可能成为一个原始生长点，而每个组织块只是一个原始生长点，组织块的数量限制了原始生长点数量。但两种方法分离到的成纤维细胞传到3代以后，其生长无差别。

参考文献：

[1] 冯 颖.大鼠皮肤成纤维细胞分离培养方法的研究[J].吉林农业，2014，23（21）：1.

[3] 金仁桃，章孝荣，汪存利，等.关于成纤维细胞培养的几点体会[J].黑龙江动物繁殖，2003，11（3）：8-9.

[2] 王 亮，刘婷婷，彭 涛，等.荷斯坦奶牛耳组织成纤维细胞分离培养及冷冻保存方法研究[J].黑龙江畜牧兽医，2006（5）：9-12.

[4] 项碧飞，孟宇航，郭春华，等.鸭胚成纤维细胞培养技术的改良[J].四川畜牧兽医，2008（6）：29-30.

[5] 蒋 俊，徐 瑗，尚宇阳，等.介绍一种简易的成纤维细胞培养方法[J].实用手外科杂志，2001，15（2）：97.

[6] 郭志林，杨永梅，赵明德，等.野牦牛成纤维细胞分离培养与部分生物学特性观察[J].中国细胞生物学学报，2013，35（12）：1-5.

[7] 陈士恩，仝伟建，郭鹏辉.早胜牛胚胎和耳缘成纤维细胞分离培养与鉴定[J].中国畜牧兽医，2012，39（3）：148-152.

[8] 孟凡华，肖红梅，张 东，等.蒙古绵羊胎儿皮肤成纤维细胞分离培养与特性分析[J].中国畜牧兽医，2012，39（3）：129-133.

[9] 信吉阁，成文敏，潘伟荣，等.猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2013（5）：1-5.

[10] 方俊顺，陶 勇，章美玲，等.黑麂耳成纤维细胞培养及异种重构胚构建[J].农业生物技术学报，2007，15（2）：228-232.