崔相勇，穆姣姣，周长民，张凤清，陈学辉

（沈阳食品检验所，沈阳 110022）

高效液相色谱-串联质谱法测定花椒粉中的松香酸

崔相勇，穆姣姣，周长民，张凤清，陈学辉

（沈阳食品检验所，沈阳 110022）

采用高效液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）法来测定花椒粉中松香酸的含量。提取方法采用乙醇超声提取法，以乙腈及水（含0.1%甲酸）为流动相进行梯度洗脱，采用反相高效液相色谱分离，通过带有电喷雾离子化源的串联质谱仪，以多反应监测模式检测。该法线性范围为0.1～2mg/kg，平均回收率为90%～103%，相对标准偏差≤8.8%，方法的检出限为0.1mg/kg。

高效液相色谱-串联质谱法；松香酸；花椒粉；测定；多反应监测模式

松香酸为松香的主要成分，松香为松科植物马尾松或其同属植物树干中取得的油树脂，经蒸馏除去挥发油后的遗留物。松香中主要成分为树脂酸，约占85%～95%，而松香酸是树脂酸的主要成分［1］。有些不法商贩在花椒粉生产过程中添加松香，推测目的是为了起到防腐和加香的作用，因此建立花椒粉中松香酸的检测方法就显得尤为必要，进而检测掺假的花椒粉。目前，测定松香酸的方法主要有高效液相色谱法及液相色谱-串联质谱法［2－6］，测定花椒粉中的松香酸还未见报道。本研究采用LC-MS/MS法来测定花椒粉中的松香酸，提取试剂为乙醇，以乙腈及水（含0.1%甲酸）为流动相进行梯度洗脱，经过反相色谱分离后以多反应监测模式进行检测。

1 材料和方法

1.1 仪器

API 4000型三重四极杆串联质谱仪（配有离子喷雾离子源以及Analysis 1.4.2数据处理系统） 美国Applied Biosystem公司；LC-20A液相色谱仪（包括二元输液泵及自动进样器） 日本岛津公司。

1.2 药品及试剂

松香酸标准品（含量85.0%），批号：173130250，购自Sigma公司；乙醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯；实验室用水为高纯水。

1.3 标准储备溶液

精密称取松香酸0.1000g于100mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度，作为标准储备溶液。此标准储备溶液每1mL相当于1.0mg松香酸。

1.4 色谱条件

色谱柱：资生堂C8柱（2.1mm×50mm，3.5μm颗径）；流动相：乙腈-水（含0.1%甲酸）；流速：0.4mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL。梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.5 质谱条件

采用电喷雾离子化源；离子喷射电压：5000V；温度：550℃；源内气体1（GS1，N2）压力：60psi；气体2（GS2，N2）压力：60psi；气帘气体（N2）压力：15psi；正离子方式检测；松香酸的解簇电压（DP）为55V，碰撞能量（CE）为20eV；用于定量分析的离子反应为303.4～123.5m/z；用于监测的离子反应为303.4～149.3m/z，碰撞能量（CE）为26eV；松香酸结构及［M＋H］＋的产物离子扫描质谱图见图1。

图1 松香酸的结构及［M＋H］＋的产物离子扫描质谱图

1.6 花椒粉样品的预处理

称取花椒粉样品1g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入20mL乙醇，涡旋混匀后超声提取20min，转移至25mL容量瓶中，并用乙醇定容至刻度，摇匀后吸取一定量液体经0.22μm滤膜过滤，取20μL供LC-MS/MS分析。

1.7 空白花椒粉萃取液制备

选择在生产过程中未添加松香的花椒粉。按1.6试样处理方法提取，经0.22μm有机滤膜过滤。必要时进行LC-MS/MS分析，以确定在松香酸出峰处不存在干扰。

2 结果与讨论

2.1 色谱行为和专属性

按“花椒粉样品的预处理”操作，分别制备空白花椒粉样品、空白花椒粉加入松香酸标准溶液（相当于含2mg/kg松香酸的花椒粉样品）进行测试。典型色谱图分别见图2中A和B。结果表明：空白花椒粉中的内源性物质不干扰松香酸的测定。

图2 测定花椒粉中松香酸的典型MRM色谱图

2.2 线性范围和灵敏度

取空白花椒粉萃取液，依次加入适量松香酸标准系列溶液，配制成相当于花椒粉浓度为0.1，0.2，0.5，1，2mg/kg的样品萃取液，按“花椒粉样品的预处理”项下操作，记录色谱图；以待测物浓度为横坐标，待测物峰面积为纵坐标，进行回归运算，求得的直线回归方程即为标准曲线，见图3。结果表明：松香酸在0.1～2mg/kg范围内线性良好，方法检出限为0.1mg/kg（信噪比S/N＝3）。

图3 测定花椒粉中松香酸的典型标准曲线图

2.3 回收率和精密度

试验分别制备了相当于含松香酸0.1，0.5，2mg/kg的低、中、高3个浓度花椒粉样品，按1.6项的操作方法进行处理，每浓度六样本分析，并与标准曲线同时进行，以当时的标准曲线计算样品的测得浓度，求得本法的精密度与回收率。低、中、高3个浓度的回收率范围分别为90%～97%，92%～100%和91%～103%，精密度分别为5.5%，4.6%和8.8%，结果均符合相关要求。

2.4 讨论

2.4.1 质谱条件优化

质谱条件优化按以下步骤完成：将浓度为1μg/mL的松香酸标准溶液吸入注射器中，放在蠕动泵进样器上，设置蠕动泵以20μL/min的速度进样，对质谱条件进行优化，尽可能地使待测物响应信号达到最高。在优化过程中比较了松香酸正、负两种离子化方式的响应值，发现正离子化效率高于负离子化效率，而且正离子响应较为稳定，因此选择正离子扫描方式。

经过Q1全扫描，选择了响应信号最高的303.4m/z作为松香酸定量分析的母离子，在子离子扫描方式下，寻找到了一些碎片离子，其中123.5m/z响应最高，149.3m/z次之，在多反应监测扫描模式下，选择303.4～123.5m/z用于松香酸的定量分析。在蠕动泵持续进样的情况下，对各项质谱参数进行优化，使得待测物响应值达到最高。

2.4.2 色谱条件优化

虽然质谱分析的专属性较高，但是还需要将样品中的内源性物质与待测物进行分离，以减少对测定产生干扰，所以在试验过程中对色谱条件进行了选择及优化。

松香酸在小粒径的C18色谱柱上保留较强，色谱峰峰形较差，故试验中选择了保留能力较弱的C8柱。应用反相色谱条件时，LC-MS/MS分析方法应用的有机相主要为甲醇和乙腈，选用乙腈作为有机相时，松香酸的色谱行为较好。试验中考虑到甲酸能够改善峰形，使待测物与内源性物质充分分离，所以选择了0.1%的甲酸作为水相。

2.4.3 提取条件的选择

试验中考察了甲醇和乙醇作为提取试剂的提取效果，结果发现乙醇的提取效率稍高于甲醇，而超声提取的使用同样会提高待测物的提取效率，所以最终选择了用乙醇作为提取试剂进行超声提取。

2.4.4 实际样品检测

在市面上随机购买了15批次的花椒粉样品，均未检出松香酸。

3 总结

本研究首次采用高效液相色谱-串联质谱法来测定花椒粉中的松香酸，方法采用MRM进行定量，提高了选择性与专属性，排除了内源性物质的干扰。该法灵敏度较高，检出限达到0.1mg/kg，前处理方法简单，可应用于食品安全检测，有较强的实际应用价值。

［1］李富贤，米彩峰，石会丽.RP-HPLC测定清毒素胶囊中松香酸的含量［J］.中国中药杂志，2008，33（9）：1086-1087.

［2］仇雅静.高效液相色谱法检查骨筋丸胶囊中非法添加的松香酸［J］.药物鉴定，2011，20（4）：39.

［3］张妤琳，曹玲，谭力，等.液质联用技术用于沉香中非法掺入含松香酸类物质的检测［J］.中成药，2011，33（5）：844-847.

［4］陈安珍，沙启营，单秀明，等.跌打片中松香酸的HPLC和HPLC-MS/MS检测方法研究［J］.中成药，2013，35（9）：1940-1942.

［5］王英锋，魏小燕.HPLC测定枫香脂碱提物中脱氢松香酸和松香酸的含量［J］.中国中药杂志，2013，38（1）：57-58.

［6］张苏珍，耿志明，王道营.固相萃取-高效液相色谱法检测肉鸭表皮组织中的松香酸［J］.食品科学，2014，35（4）：82-85.

Determination of Abietic Acid in Pepper Powder by LC-MS/MS

CUI Xiang－yong，MU Jiao-jiao，ZHOU Chang-min，ZHANG Feng－qing，CHEN Xue-hui
（Shenyang Food Inspection Institute，Shenyang 110022，China）

To develop and validate a sensitive and specific LC-MS/MS method for the determination of abietic acid in pepper powder.The analyte is extracted from pepper powder by ethanol and separated by RP-HPLC with acetonitrile and 0.1%formic acid as the mobile phase.Detection is carried out by multiple reaction monitoring（MRM）on an API 4000LC-MS/MS system with an electrospray ionization（ESI）interface.The assay is linear in a range of 0.1～2mg/kg，and the average recovery is 90%～103%with RSD≤8.8%.The detection limit of the method is 0.1mg/kg.

LC-MS/MS；abietic acid；pepper powder；determination；MRM

TS264.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.03.030

1000-9973（2017）03-0127-03

2016－09－12

崔相勇（1985－），男，吉林安图人，工程师，硕士，研究方向：药物分析与食品检测。