祝浩明，王娟娟，舒 梦，陈 溪，孙 强，王 君，胡霞敏，程 静

褐藻提取物鹅掌莱酚（Eckol）抗肿瘤作用的初步探究

祝浩明，王娟娟，舒 梦，陈 溪，孙 强，王 君，胡霞敏，程 静*

（武汉科技大学医学院，湖北 武汉 430065）

目的 初步探究褐藻提取物鹅掌莱酚（Eckol）的抗肿瘤作用。方法 观察Eckol对小鼠艾氏腹水瘤、S180肉瘤和离体胃癌SGC7901细胞的影响，通过计算胸腺指数、脾指数了解Eckol对小鼠免疫器官的作用。结果 艾氏腹水瘤模型中，Eckol可明显延长小鼠生存时间（P＜0.05）。与对照组（生理盐水组）相比，Eckol对S180肉瘤小鼠肿瘤的形成和发展有明显的抑制作用，可显著降低肉瘤组织重量，改善其恶变程度。其中低剂量组（Eckol浓度为0.25 mg/L）的抗肿瘤功效最为明显（P＜0.01），抑瘤率达48.49%。与对照组相比，Eckol对动物胸腺指数和脾指数影响不大。体外研究结果显示，Eckol对SGC7901细胞的分裂增殖有明显抑制作用（P＜0.01），且抑制作用呈剂量依赖性。结论 褐藻提取物Eckol具有明显的抗肿瘤作用。

褐藻；鹅掌莱酚；抗肿瘤

褐藻是重要的药用和食用资源。褐藻门约有250属，1 500种以上，是海藻中比较高级的一大类群，具有分布广、藻体大和生长快等特点，经济价值高[1]。褐藻多酚（Phlorotannin）是从Ecklonia cava、Ecklonia maxima、Eckloniastolonifera等褐藻中提取分离得到的多酚类物质，其基本结构单元为间苯三酚。鹅掌莱酚（Eckol）是间苯三酚的三聚体，因其独特的化学结构而具有较多的生物学活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎[2，3]、预防骨质疏松[4]，但其抗肿瘤作用还未见报道。本实验采取体内、体外实验方法，观察Eckol对小鼠艾氏腹水瘤、S180肉瘤和体外培养的肿瘤细胞的作用，初步探究其抗肿瘤作用。

1 材料和试剂

1.1 试剂和药品

Eckol由武汉南泰科技开发有限公司提供，为黄褐色粉末，难溶于水。羟基喜树碱由成都普瑞法有限公司生产。Ⅳ型胶原酶、噻唑蓝（MTT）、放线菌素D、脂多糖（LPS）均来自Sigma公司。RPMI-1640培养基、新生牛血清（NBS）购于GIBCO公司。

1.2 动物及分组

昆明种小鼠（购于湖北省实验动物中心），SPF级，雄性，4～5月龄，体重23～25 g。

艾氏腹水瘤实验：将小鼠按体重平行随机分为对照组（生理盐水组）和Eckol低、中、高剂量组（药物浓度分别为0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L），共4组，每组10只，并用苦味酸进行编号。

S180肉瘤实验：将小鼠按体重平行随机分为对照组（生理盐水组）和Eckol低、中、高剂量组（药物浓度分别为0.25 mg/L、0.50 mg/L、1.0 mg/L）以及羟基喜树碱阳性对照组（药物浓度为1.0 mg/L），共5组，每组10只，并用苦味酸进行编号。

1.3 仪器和设备

倒置生物显微镜（德国徕卡）、Bio-Tek酶标仪、CO2培养箱（美国3111）、721分光光度计、分析天平（美国奥豪斯）。

2 方法

2.1 体内抗肿瘤实验

2.1.1 褐藻提取物Eckol对艾氏腹水瘤的抑制作用 对各组小鼠进行预防灌胃给药，给药量均为0.2 ml/10 g，1次/d，共7 d。第7 d灌胃给药1 h后，取艾氏腹水瘤瘤株已传代10 d的保种小鼠，无菌条件下抽取腹水，显微镜下计数，以无菌生理盐水按1∶5比例稀释肿瘤细胞，混匀后，在无菌条件下，按0.5 ml/只接种至实验小鼠腹腔中。接种后按上述方法再连续给药15 d，观察小鼠的活动状况并记录小鼠生存时间，超过15 d的按15 d算。按以下公式计算生命延长率：

生命延长率（%）=（剂量组平均生存天数-对照组平均生存天数）/对照组平均生存天数×100%

剂量组：Eckol低、中、高剂量组。

2.1.2 Eckol对S180肉瘤的抑制作用 对各组小鼠采用预防灌胃给药，给药量均为0.2 ml/10 g，1次/d，共7 d。第7 d灌胃给药1 h后，取S180肉瘤瘤株已传代10 d的保种小鼠，无菌条件下抽取腹水，显微镜下计数，以无菌生理盐水调整肿瘤细胞数至2.5×107，混匀后，每只小鼠右腋下接种肿瘤细胞悬液0.4 ml。接种24 h后，对照组以及Eckol低、中、高剂量组按上述方法给药，羟基喜树碱阳性对照组腹腔注射给药，给药量为0.2 ml/10 g，各组连续给药10 d，最后一次给药24 h后记录小鼠体重，颈椎脱臼法处死小鼠，剥取各组小鼠皮下瘤组织，取胸腺和脾脏，分别称取湿重并记录，按下列公式计算抑瘤率、胸腺指数和脾指数。此外，每组选取一例瘤组织进行组织切片HE染色，观察肿瘤细胞形态。

抑瘤率（%）=（对照组瘤重-剂量组瘤重）／对照组瘤重× 100%

脾指数=小鼠脾重（mg）／小鼠体重（g）

胸腺指数=小鼠胸腺重（mg）／小鼠体重（g）

2.2 体外抗肿瘤活性实验

Eckol对胃癌SGC7901细胞株生长增殖抑制作用实验：采用MTT法，用10%RPMI-1640生长培养基培养细胞，收集对数期细胞，用2%RPMI-1640维持培养基，调节细胞浓度，除空白调零孔外，每孔均匀接种约1×104个细胞，200 μl到96孔板中。空白调零孔仅加入10%RPMI-1640培养液180 μl，于37℃、饱和蒸汽、5%CO2培养箱培养过夜，倒置显微镜下观察。除空白调零孔及正常对照孔外，每孔分别加入浓度为0.125 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L的20 μl Eckol提取液，每种浓度各设5个复孔。正常对照孔仅加入PBS 20 μl，继续培养24 h。弃去孔内液体，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，于37℃、饱和蒸汽、5%CO2培养箱中孵育4 h，1 000 r/min平板离心机离心后，弃上清，晾干，加入200 μl DMSO，在摇床上低速震荡10 min，使结晶完全溶解后，用酶标仪560 nm测每孔光密度值（OD值），按以下公式计算细胞增殖抑制率：

细胞增殖抑制率（%）=（1-药物处理组OD值/正常培养液对照组OD值）×100%

药物处理组：指不同浓度的Eckol提取液组；

正常培养液组：指与药物处理组同条件下的PBS组。

3 结果

3.1 Eckol对艾氏腹水瘤的抑制作用

如表1所示，与对照组相比，Eckol中、高剂量组小鼠生存时间分别为（11.3±2.1）d、（11.3±3.0）d，差异有显著性（P＜0.05），说明Eckol在一定浓度范围内对肿瘤的生长和发展有显著的抑制作用，并能延长腹水瘤小鼠生存时间。

表1 Eckol对艾氏腹水瘤小鼠生存时间的影响

3.2 Eckol对S180肉瘤的抑制作用

如表2所示，相对于对照组的肿瘤生长良好，Eckol低、中、高剂量组肿瘤的生长均受到抑制，抑瘤率分别为48.49%、36.96%和36.65%，其中以低剂量组抑瘤效果最为明显，抑瘤率明显高于羟基喜树碱阳性对照组。说明Eckol对S180肉瘤的体内增殖具有良好的抑制活性。图1显示，S180肉瘤经HE染色后，用高倍镜进行观察，对照组的癌细胞大小和形态完全不一致，细胞核变大，核染色较深，细胞核和细胞浆之间的比例增大，核的大小、形状、染色不一，多处可见核分裂相，不对称性、多极性、顿挫性等病理性分裂相增多。羟基喜树碱阳性对照组可见大片细胞死亡，残存的瘤细胞大小和形态趋近一致。Eckol低、中、高剂量组的死亡细胞数呈剂量依赖性，尤其高剂量组呈大面积的索式死亡区，瘤细胞大小和形态较均一，经Eckol剂量处理后细胞大小和形态都发生了变化。与对照组比较，羟基喜树碱阳性对照组中羟基喜树碱能明显降低小鼠的胸腺指数和脾指数。而Eckol低、中、高剂量组小鼠胸腺指数分别为对照组的76.32%、87.72%和93.05%，差异无显著性。

表2 Eckol对小鼠S180实体瘤重量的影响

图1 Eckol对肿瘤组织形态学的影响

3.3 Eckol对体外培养的SGC7901细胞的影响

如表3所示，Eckol可能并非通过免疫调节作用发挥间接抗肿瘤效应，而是通过直接细胞毒性发挥效应。为了解Eckol对肿瘤细胞的直接作用，我们利用经典MTT法对其进行验证。如图2所示，Eckol对胃癌SGC7901细胞的增值抑制作用呈剂量依赖性，随着剂量的增加，细胞生存率不断下降，即增殖抑制率呈上升趋势。且与对照组比较，各剂量组均存在显著性差异，说明Eckol对SGC7901细胞的体外增殖具有明显的抑制作用。

表3 Eckol对小鼠胸腺指数和脾指数的影响（±s，mg/g）

表3 Eckol对小鼠胸腺指数和脾指数的影响（±s，mg/g）

注：与对照组比较，无显著性差异

组别 胸腺指数 脾指数对照组Eckol低剂量组Eckol中剂量组Eckol高剂量组羟基喜树碱阳性对照组3.754±1.100 2.865±0.740 3.293±0.510 3.493±0.790 2.111±0.650 8.145±1.920 5.628±1.010 6.835±1.370 6.303±1.230 4.848±1.850

图2 Eckol对细胞生存率的影响（24 h）

4 讨论

如今癌症已成为威胁人类健康、致人死亡的重要病因。目前临床上治疗癌症的化疗药物具有选择性低、对正常组织伤害性大的特点。大量研究表明，从海藻中提取的很多活性成分具有抗肿瘤作用。魏玉西等[5]发现鼠尾藻多酚类化合物具有较强的抗肿瘤活性，对离体人肺腺A-549细胞、人肝癌BEL-7402细胞的增殖具有很强的抑制作用。史大华等[6]在低分子量的岩藻多糖的研究中也证实岩藻多糖具有抗肿瘤作用。本实验研究发现，在一定浓度范围内，Eckol能延长艾氏腹水瘤小鼠生存时间；Eckol剂量组的小鼠毛发普遍要比对照组的有光泽，行动也更活跃；在S180移植性实体瘤实验中，Eckol剂量组的平均瘤重比对照组轻，说明Eckol具有明显的抑制肉瘤生长的作用。在与羟基喜树碱阳性对照组比较时发现，羟基喜树碱阳性对照组小鼠的胸腺指数和脾指数显著降低，而给予Eckol的高、中、低剂量组与阳性对照组相比，其胸腺指数均呈上升趋势，且胸腺指数的上升为剂量依赖性，高剂量组的胸腺指数最大，与阳性对照组相比差异有显著性。高剂量组的S180小鼠脾指数显著高于阳性对照组，差异有显著性。而剂量组小鼠胸腺指数和脾指数明显低于对照组，但不存在显著性差异。说明羟基喜树碱的组织毒性远远大于Eckol，羟基喜树碱能致免疫器官胸腺和脾脏萎缩。在MTT法体外实验中，离体的人胃癌细胞株SGC7901细胞经Eckol处理24 h，随着Eckol浓度的增加，存活细胞数显著下降，且除低剂量组外，细胞增殖抑制率与对照组比较有显著性差异，说明一定剂量范围的Eckol对离体分离的人癌细胞具有抑制作用。多项研究表明，Eckol类化合物在一些细胞信号通路中起着重要作用[7，8]。而Lee S H[9]发现从褐藻Ecklonia Cave中分离提取的褐藻多酚通过诱导肿瘤细胞凋亡，对人MCF-7肺癌细胞株的体外增殖具有显著的抑制作用。本实验只是对Eckol抗肿瘤作用做初步研究，详细的抗肿瘤机制以及可能涉及分子水平的信号通路还有待深入研究。

[1]秦绪龙，万升标，江涛.Eckol类褐藻多酚的研究进展[J].海洋湖沼通报，2007（1）：176-181.

[2]Joung E J，Lee M S，Choi J W.Anti-inflammatory effects of phlorofucofuro eckol B-rich ethyl acetate fraction obtained from Myagropsismyagroides on lipopoly-saccharide stimulated RAW 264.7 cells and mouse edema[J].Int Immunopharmacol，2012（14）：471-480.

[3]Ha H L，Shin H J，Feitelson M A，et al.Oxidative stress and antioxidants in hepatic pathogenesis[J].World J Gastroenterol，2010（16）：6035-6043.

[4]Karadeniz F，Ahn B N，Kim J A，et al.Phlorotannins suppress adipogenesis in preadipocytes while enhancing osteoblastogenesis in pre-osteoblasts [J].Archives of Pharmacal Research，2015（38）：2172-2182.

[5]魏玉西，孙峋，王长云，等.鼠尾藻多酚的抗肿瘤活性研究[J].中草药，2008，39（1）：93-95.

[6]史大华，刘玮炜，刘永江，等.低分子量海带岩藻多糖的制备及其抗肿瘤活性研究[J].时珍国医国药，2012，23（1）：53-55.

[7]王芳，王勤，蒋志军.InsP 6诱导荷S180小鼠不同器官中MDA含量和红细胞中SOD活性改变[J].中国微循环，2001，5（1）：30-32.

[8]陈晓峰，顾振纶，梁中琴.基质金属蛋白酶与肿瘤侵袭和转移研究进展[J].中国药理学通报，2001，17（3）：253-255.

[9]Lee S H.Anti-inflammatory Mechanisms of Phlorotannins Derived from Eiseniabicyclis and their inhibitory effect on Matrix Metaloproteinases[D]. South Korea：Pukyong National University，2010.

（*通讯作者：程静）

R285.6

A

1671-1246（2017）05-0093-03

注：本文系武汉科技大学大学生科技创新基金研究项目（15ZRA164）