杨小飒　李培炎　李杰

[摘要] 目的 探讨哇巴因（ouabain）对人胶质瘤U87-MG细胞死亡的影响及具体机制。 方法 将培养的U87-MG细胞随机分为正常对照（Control）组和ouabain组，分别加入常规培养基和不同浓度ouabain（0.05、0.5、2.5、25 μmol/L）干预24 h，光学显微镜观察ouabain干预后24 h细胞的形态改变，MTT实验检测细胞活力，免疫印迹法（Western blot）检测Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达变化。 结果 与Control组比较，ouabain显著降低U87-MG细胞活力（均P < 0.01），且呈现浓度依赖性；高浓度ouabain（2.5、25 μmol/L）与Control组相比能够降低U87-MG细胞中p-Akt、mTOR和p-mTOR的表达（均P < 0.01）。 结论 高浓度ouabain可能通过抑制胞内Akt/mTOR信号通路，降低肿瘤细胞活力并最终引起细胞死亡。

[关键词] 哇巴因；胶质瘤；人胶质瘤U87-MG细胞；Akt/mTOR信号通路

[中图分类号] R730.264 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）01（c）-0004-04

[Abstract] Objective To explore the effect of ouabain on the human glioma U87-MG cells death and the underlying mechanism. Methods U87-MG cells were randomly divided into control group and ouabain group， which were treated with conventional medium and different concentrations of ouabain （0.05， 0.5， 2.5 and 25 μmol/L） for 24 h， respectively. The morphologic changes induced by ouabain treatment were observed with the light microscope. Cell viability was assessed with MTT assay and Western blot was used to detect the protein expression of Akt， p-Akt， mTOR and p-mTOR. Results Compared to control group， the viability of U87-MG cells treated with ouabain was significantly reduced （all P < 0.01） in a dose-dependent manner. Besides， Western blot indicated that higher concentrations of ouabain （2.5 and 25 μmol/L） downregulated the expression of p-Akt， mTOR and p-mTOR when compared to control group （all P < 0.01）. Conclusion Higher concentrations of ouabain depressed U87-MG cells viability and ultimately induced cell death via suppression of Akt/mTOR signaling pathway.

[Key words] Ouabain； Glioma； Human glioma U87-MG cells； Akt/mTOR signaling pathway

胶质瘤（glioma）是恶性程度最高的常见原发性脑肿瘤之一，约占中枢神经系统恶性肿瘤的80%[1]，尽管目前已有多种治疗方案，但胶质瘤患者的中位生存期仅为14个月，治疗失败的主要原因是逐渐增强的化、放疗抵抗[2]，因此亟待发现新的治疗策略以提高胶质瘤患者的治疗效果。

哇巴因（ouabain）等强心苷类药物对心肌收缩力的积极作用源于其对Na+/K+-ATP酶的高度特异性抑制，在临床上被用于治疗心力衰竭和其他心脏疾病[3]。最新研究表明，ouabain等强心苷类药物能够通过调节胞内多种信号通路抑制肿瘤细胞的增殖，阻断肿瘤的生长[4]。尽管已有较多的数据证明ouabain具有抗癌作用，但具体机制尚不明确。

Akt/mTOR信号通路是参与调节细胞生长、凋亡和细胞骨架重排的重要胞内信号转导通路，在肿瘤形成和和病理进展过程中发挥重要作用[5]。作为癌症中最常见的异常调节激酶通路，Akt/mTOR信号通路被证实是多种癌症的治疗靶点[6]。因此，本文以人胶质母细胞瘤U87-MG细胞为研究对象，观察特异性Na+/K+-ATP酶抑制剂ouabain对其凋亡的影响，初步探讨Akt/mTOR信号通路在其中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人胶質瘤U87-MG细胞（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心），ouabain（美国Sigma公司），DMEM高糖培养基、胎牛血清和胰蛋白酶（美国Gibco公司），四甲基偶氮唑盐（MTT）（美国Promega公司），兔抗人一抗Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、β-actin（美国Abcam公司），辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（美国KPL公司），Amersham Imager 600化学发光成像系统（美国GE公司）。

1.2 细胞培养

U87-MG细胞使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃培养箱（5% CO2）常规培养，细胞汇合度达90%后消化传代，常规培养7 d后进行后续实验。将U87-MG细胞分为正常对照（Control）组和ouabain（0.05、0.5、2.5、25 μmol/L）组。Control组不进行ouabain干预。

1.3 MTT法检测细胞存活率

U87-MG细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板中，每孔100 μL。常规培养24 h后，ouabain组细胞加入含不同浓度ouabain的培养基，Control组加入等体积的常规培养基，空白孔单加培养基，每组设5个复孔，继续培养24 h。之后每孔加入20% MTT，置于37℃培养箱孵育2 h，酶标仪测定490 nm处的OD值，计算细胞活力。细胞活力=（OD实验孔-OD空白孔）/（OD对照孔-OD空白孔）×100%，使用GraphPad Prism 6.0软件制作统计图。

1.4 Western blot检测蛋白表达量

U87-MG细胞经不同浓度ouabain干预24 h后，PBS漂洗3次，加入RIPA蛋白裂解液和PMSF蛋白酶抑制剂，将细胞收集至1.5 mL离心管，使用组织破碎仪3000次/min破碎3 min，12000 r/min离心取上清，-80℃保存待用。将各组的蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后使用5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗（Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR，1∶1000稀释）4℃孵育过夜，相应二抗（1∶5000稀释）室温孵育1 h，TBST充分洗膜。滴加ECL显影液，放入Amersham Imager 600中进行显影。采用Image J灰度分析软件测定蛋白条带灰度值，目的蛋白的相对表达量以目的蛋白与β-actin的蛋白条带灰度值之比表示。

1.5 统计学方法

使用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ouabain对U87-MG细胞活力的影响

ouabain干预24 h后，U87-MG细胞出现形态不规则、折光度变差、皱缩甚至漂浮，随着ouabain浓度的增加，死细胞数量逐渐增多（图1）。MTT结果显示，ouabain处理24 h后U87-MG细胞活力与Control组比较均显著降低（均P < 0.01），且呈现浓度依赖性（图2）。

2.2 ouabain对U87-MG细胞Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响

与Control组比较，0.05 μmol/L ouabain组p-Akt蛋白表达量上升（P < 0.01），而mTOR和p-mTOR下降（P < 0.05或P < 0.01）。与Control组相比，0.5 μmol/L ouabain仅降低p-Akt表达（P < 0.01）。另外，较高浓度ouabain（2.5、25 μmol/L）与Control组相比均能降低p-Akt、mTOR和p-mTOR表达（P < 0.05或P < 0.01）。然而，不同浓度ouabain对Akt表达无显著影响（P > 0.05）（图3）。

3 讨论

胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤之一，临床预后较差，因而关于其治疗策略的研究成为近年来的焦点[7]。由于人胶质瘤U87-MG细胞对强心苷类药物较为敏感，而且ouabain作为一种液态、可溶的强心苷类药物可通过血脑屏障[8]，因此本文采用ouabain干预U87-MG细胞，开展胶质瘤治疗的实验研究。

在胶质瘤发生过程中，Na+/K+-ATP酶不仅能够稳定离子平衡，更在肿瘤进展中发挥重要作用[9]。Ahmed等[10]研究表明，抑制Na+/K+-ATP酶活性可影響细胞黏附和迁移功能，并阻断胞内PKC、NF-κB等信号通路，从而引起肿瘤细胞凋亡。ouabain等强心苷类药物是Na+/K+-ATP酶的天然抑制剂，在其α亚基上有多个强心苷类药物的结合位点[11]。Lin等[12]研究发现，ouabain能降低Na+/K+-ATP酶α亚基的含量，抑制其活性，减弱肿瘤细胞生长能力，从而引起肿瘤细胞死亡。Trenti等[13]研究表明，ouabain通过调控Na+/K+-ATP酶的反向转运功能以及下调抗凋亡蛋白Bcl-2，从而抑制肿瘤细胞的增殖。本实验通过不同浓度ouabain干预后发现，U87-MG细胞活力较Control组明显降低，并呈浓度依赖性，这提示ouabain能促进胶质瘤U87-MG细胞凋亡，可能与改变胞内某些信号通路有关。

研究表明，Na+/K+-ATP酶可在Akt/mTOR、Ras和PKC等多种信号通路中发挥作用[14]，促进肿瘤的侵袭和转移，其中Akt/mTOR通路对于胶质瘤等多种肿瘤的病理进展至关重要[15]。Akt、mTOR以及磷酸化蛋白的上调表达，可直接或间接抑制Bax、caspase-9等凋亡相关蛋白的磷酸化，降低细胞凋亡，从而引起正常生理功能的恶化[16]。另外，mTOR被证实其磷酸化激活受到AMPK等其他通路的抑制，而AMPK/mTOR通路参与细胞自噬的负性调节，由于细胞自噬能够促进药物对肿瘤的抑制，因此该通路可促进肿瘤的生长[17]。Liu等[18]研究发现，Akt/mTOR通路抑制胶质瘤中的细胞凋亡，药物抑制Akt/mTOR通路以及Akt、mTOR的磷酸化可上调下游凋亡相关蛋白，从而导致肿瘤细胞的大量凋亡。研究表明，ouabain能够通过调节PI3K、Ras和PKC等信号通路，降低Akt、mTOR的磷酸化，减弱细胞生长能力，从而引起肿瘤细胞凋亡[19]。Wang等[20]研究表明，ouabain和地高辛等强心苷类药物能够增强AMPK的磷酸化激活从而降低mTOR磷酸化水平，并通过调节ERK1/2和AMPK/mTOR等胞内信号通路引起细胞自噬，从而发挥抗肿瘤作用。本实验中，Western blot结果显示，0.05 μmol/L ouabain导致p-Akt表达升高而mTOR和p-mTOR表达下降，可能是由于低浓度ouabain对Na+/K+-ATP酶的轻度抑制，刺激了细胞内Akt等信号通路的活化，从而导致Akt的磷酸化活性形式p-Akt有所增加，而mTOR可能受到AMPK信号通路的调控导致其自身以及磷酸化活性形式p-mTOR都有所下降；当ouabain浓度增加至0.5 μmol/L时，Akt的磷酸化激活由于ouabain的浓度增加而有所降低，但mTOR可能受到Akt通路的磷酸化激活同时又被AMPK通路所抑制，因而其磷酸化水平未发生变化；高浓度ouabain（2.5、25 μmol/L）能够降低Akt和mTOR的磷酸化水平，同时U87-MG细胞活力受到抑制，且形态学也显示了严重的细胞死亡。上述结果表明，高浓度的ouabain可能通过抑制胞内Akt/mTOR通路，抑制U87-MG细胞生长进而引起细胞死亡，发挥抗胶质瘤作用。

綜上所述，本文采用不同浓度ouabain干预人胶质瘤U87-MG细胞后发现，高浓度ouabain通过下调Akt/mTOR信号通路相关蛋白，抑制U87-MG细胞活力，从而导致细胞死亡，这为ouabain抗肿瘤特性的机制研究提供了更多的数据支撑，更提示ouabain可作为胶质瘤治疗的潜在用药。

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（收稿日期：2016-10-12 本文編辑：程 铭）