邹小辉 邵博 王敏 屈建国 鲁茁壮 洪涛

100052 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室(邹小辉、邵博、王敏、屈建国、鲁茁壮、洪涛)；475000 开封，河南化工技师学院(邵博)

·论著·

建立基于miniSOG标签的光镜-电镜关联方法观察腺病毒IX蛋白的亚细胞定位

邹小辉 邵博 王敏 屈建国 鲁茁壮 洪涛

100052 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室(邹小辉、邵博、王敏、屈建国、鲁茁壮、洪涛)；475000 开封，河南化工技师学院(邵博)

目的 建立光镜-电镜关联方法观察腺病毒蛋白IX的细胞内定位。方法 miniSOG是新发现的能够被荧光显微镜和电子显微镜解析的蛋白标签。通过PCR方法克隆腺病毒结构蛋白IX与miniSOG的融合基因IXSOG，将其构建至真核表达载体，转染细胞；通过荧光显微镜确定IXSOG蛋白表达的细胞，之后对转染细胞进行原位固定、光氧化、制备超薄切片，用电镜观察细胞内IXSOG融合蛋白的表达及分布情况。结果 在蓝光激发下，miniSOG能够发射绿色荧光。定位选择光氧化形成嗜锇颗粒的IXSOG表达细胞进行电镜观察，结果显示IX蛋白在细胞核内多个区域形成点状聚集或包涵体。结论 建立了依赖miniSOG标签的的光镜-电镜关联方法，该方法可用于病毒蛋白细胞内定位研究。

Fund programs: National Natural Science Foundation of China (31400156);National Science and Technology Major Project of China(2014ZX10004002-004)

电子显微镜超薄切片技术是将细胞或组织样品进行固定、脱水、包埋、聚合、切片并染色，然后在电镜下观察的一种技术，染色主要依赖于重金属盐对各种细胞或病毒结构结合程度不同，使得各种细胞器或病毒在电镜下形成反差而得以区分，借助超薄切片技术可以研究病毒与细胞之间的相互作用，如病毒的形态发生学、病毒感染细胞后导致的细胞形态改变等研究[1]。然而，由于重金属盐染色主要是提高细胞结构成分或病毒颗粒的反差，因此超薄切片技术无法观察某个蛋白在细胞内的具体定位情况。一直以来，细胞内病毒蛋白的电镜定位主要依赖于免疫电镜技术(免疫胶体金)，然而免疫电镜对抗体质量要求高，操作较繁琐；胶体金颗粒并不是目标蛋白自身，仅能近似定位目标蛋白，并不能显示目标蛋白在细胞内的精确位置[2-4]。因此，发展新的蛋白定位电镜技术非常必要。

2011年，美国加州大学Shu等[5]发明了能够用于电镜定位的蛋白标签miniSOG(Mini Singlet Oxygen Generator)，该蛋白是由拟南芥向光蛋白2(AtPhot2)的LOV2结构域突变而来，是一种含106个氨基酸残基的荧光黄素蛋白，在荧光显微镜下，miniSOG像GFP一样发射绿色荧光；在蓝光激发并有氧气存在时，其能催化二氨基联苯胺(DAB)聚合形成嗜锇颗粒(DAB的光氧化)，当使用四氧化锇对电镜标本进行后固定时，DAB聚合物能够吸附锇颗粒，在透射电镜下呈深色，即miniSOG示踪部位能够被电镜解析[6-8]，实现了蛋白观察的光镜与电镜关联(Correlative light and electron microscopy，CLEM)。

人腺病毒(Human Adenovirus, HAdV)是直径约90 nm的正二十面体无包膜病毒，其主要衣壳蛋白包括五邻体和六邻体；次要衣壳蛋白包括Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅲa等蛋白，其中IX蛋白是一个含有140个氨基酸残基的多肽，主要是以三聚体形式将9个六邻体连接在一起形成腺病毒二十面体表面的结构[9]，IX蛋白还具有转录因子活性，在病毒复制过程中参与调控病毒和细胞基因表达[10]。此外，在腺病毒感染细胞或胞内单独表达IX蛋白时，都能在细胞核内形成特殊的核内包涵体结构，由于这些结构的密度较低，在电镜下只能观察到无定形的包涵体[11]。本研究中，我们试图建立利用miniSOG蛋白标签的的CLEM技术，并利用该技术观察腺病毒IX蛋白的细胞内定位情况。

1 材料与方法

1.1 材料 293细胞为本室保存，pcDNA3-TPL质粒为CMV启动子下游含人41型腺病毒三连体前导序列TPL的pcDNA3质粒(TPL有利于提高目的基因表达)，pcDNA3-miniSOG为克隆有miniSOG基因的pcDNA3质粒，pShuttle-IXSOG为IX与miniSOG融合表达载体(将IX与miniSOG的融合蛋白命名为IXSOG)，它们为本室前期构建[12]。转染试剂Lipofectamine 3000购自美国Life technologies公司。Q5高保真DNA聚合酶、限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ、NcoⅠ为美国NEB公司产品。戊二醛、二甲胂酸钠、醋酸双氧铀、四氧化锇、环氧树脂Epon-812为美国SPI公司产品。二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB)为Amresco公司产品。氧气购自北京如源如泉科技有限公司。氨基三唑(Aminotriazole)为美国Chem Service公司产品。DAPI购自北京中杉金桥生物技术有限公司。引物由北京六合华大基因有限公司合成。

1.2 pTPL-IXSOG载体构建及转染实验 使用Q5高保真DNA聚合酶，以pShuttle-IXSOG为模板，使用上下游引物扩增IX与miniSOG的融合基因(IXSOG)，其中上游引物序列：5′ -ccgcggtaccatgagcaccaactcgtttgatgg-3′ ，下游引物序列：5′ ggccctcgagctagccatcc agctgcacaccaatg-3′ 。 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收，经KpnI与XhoI双酶切后与经同样双酶切的pcDNA3-TPL载体连接。连接产物转化TOP10感受态细胞，得到pTPL-IXSOG质粒。质粒经NcoI酶切鉴定后，选取鉴定正确的质粒用于测序验证。该融合蛋白在IX与miniSOG之间通过Flag接头连接，并在Flag的5′端与3′ 端分别添加Ser-Ala和Leu-Ala，且miniSOG位于IX的C端[12]。将成功构建的质粒pTPL-IXSOG与pcDNA3-miniSOG分别转染293细胞，48 h后使用多聚甲醛于室温固定15 min，PBS漂洗5 min×3次，DAPI复染5 min，PBS漂洗5 min×3次后使用荧光显微镜观察。

1.3 光氧化实验 使用Lipofectamine 3000脂质体转染试剂，参照说明书进行操作，将1 μg pTPL-IXSOG转染至12孔板293细胞(转染前一天按1∶4传代至细胞培养板中)，转染后48 h，于荧光显微镜下观察IXSOG蛋白表达情况，利用荧光指示定位IXSOG表达细胞，选取IXSOG阳性细胞进行电镜制样。细胞经2.5%戊二醛(5%戊二醛储存液经0.2 M pH7.4二甲胂酸钠1∶1稀释)于冰上固定1 h后，使用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液(pH7.4)漂洗5次，之后用封闭液(20 mmol/L氨基三唑，50 mmol/L甘氨酸，10 mmol/L氰化钾)于4 ℃封闭30 min，封闭内源性(特别是线粒体内)黄素蛋白的光氧化活性。加入新鲜配制且经氧气饱和的冰DAB(1 mg/ml，pH7.4)溶液，迅速转移至倒置荧光显微镜(Nikon, Eclipse Ti-U)，用40倍物镜对目的细胞使用蓝光照射15-20 min，荧光显微镜光源为短弧汞灯(功率100W，购自德国OSRAM GmbH)。为了维持DAB溶液的低温及足够的氧气浓度，照射期间更换2-3次DAB溶液，待IXSOG阳性细胞颜色变成淡黄时停止光照。0.1 M二甲胂酸钠缓冲液漂洗5次后，加入1% OsO4于冰上固定染色30 min，超纯水漂洗5次，然后使用2%醋酸铀染色1 h，再经乙醇于4 ℃ 进行梯度脱水(20%、50%、70%、90%、100%、100%依次各2 min)，然后使用无水乙醇于室温脱水2 min。经不同比例的Epon-812树脂与乙醇的混合物于室温(1∶3、1∶1、3∶1的混合比例各1 h)进行浸透处理，之后再使用纯树脂处理2次，每次各1 h。最后更换为Epon-812树脂，于37 ℃ 过夜，随后转移至60 ℃ 烤箱聚合48 h，修块、制备超薄切片并使用透射电镜(Tecnai 12)观察。

质粒pcDNA3-miniSOG(对照)及pTPL-IXSOG分别转染293细胞，48 h后多聚甲醛固定，DAPI复染，荧光显微镜观察miniSOG(A-C)或IXSOG(D-F)蛋白表达情况

pTPL-IXSOG转染293细胞后48 h光学显微镜下(LM)可见光(A)、荧光(B)直接观察；DAB光氧化(C)、四氧化锇固定(D)后光学显微镜观察；制备超薄切片后在电镜(EM)下观察(E)

图A为IXSOG阳性细胞的超薄切片电镜图像，图B，图C分别为图A中1和2放大后图像，箭头所示为IXSOG蛋白的点状聚集及包涵体

2 结果

2.1 pTPL-IXSOG载体的构建与鉴定 经PCR扩增获得长度为797 bp的IXSOG基因，该基因中miniSOG基因融合在IX基因3′ 端，二者融合表达。通过酶切连接操作，IXSOG克隆到pcDNA3-TPL载体，得到pTPL-IXSOG质粒。使用NcoI酶切，结果表明质粒构建正确，之后由北京六合华大基因有限公司测序验证序列无误后(结果没有显示)，用于后续实验。

2.2 荧光显微镜观察IXSOG蛋白表达 293细胞经pTPL-IXSOG质粒转染后48 h，荧光显微镜下可见到IXSOG融合蛋白的表达，经DAPI染色后，可见呈现绿色荧光的IXSOG蛋白富集于细胞核，而在对照质粒pcDNA3-miniSOG转染的细胞内miniSOG蛋白呈均匀分布(图1)。

2.3 光镜-电镜关联方法观察IXSOG蛋白的表达情况 pTPL-IXSOG质粒转染细胞后48 h，荧光显微镜下定位表达IXSOG蛋白的荧光细胞(图2B)，细胞固定后进行DAB光氧化反应，可见IXSOG表达细胞颜色变黄，而相邻的无荧光细胞(不表达IXSOG蛋白)并未见到明显的颜色变化(图2C)。光氧化后再经OsO4后固定，可见表达IXSOG蛋白的荧光细胞颜色变成深褐色(图2D)。制备成超薄切片后，使用电镜观察，可见表达IXSOG蛋白的细胞呈深色，而其他光镜下无荧光的细胞颜色较浅，二者以细胞膜为界，颜色深浅区别明显，容易辨别(图2E)。提高放大倍数后(图3)，可见深色细胞内有多处黑色成簇聚集现象，说明IXSOG蛋白能够形成点状或片状聚集，而浅色细胞中由于没有IXSOG蛋白的表达，因此没有见到该现象。结果表明胞浆中合成的IXSOG转运到胞核中形成局部聚集。我们的染色结果也提示，当过表达的IX蛋白未能及时转移到胞核时，也可能在胞浆中形成聚集。

3 讨论

近些年，通过结合荧光蛋白标记技术、荧光显微镜技术、电子显微镜技术，人们可以直接观察目标分子在细胞内的定位及运动，并解析出目标分子所在位置的细胞超微结构。随着分子生物学的深入发展，利用荧光显微镜和电子显微镜对同一细胞内同一位置的分子机器进行高精度定位和高分辨率超微结构的研究成为了非常有力的手段，这项技术称为光镜-电镜关联技术[13,14]。通过荧光显微技术对目标蛋白进行标记定位，利用电镜技术获取细胞指定部位的超微结构信息，将定位信息与结构信息进行整合处理，从而获得更加精确的蛋白定位信息。本研究中，我们参照文献[5]，选取miniSOG蛋白作为标签，与腺病毒IX蛋白融合表达，miniSOG蛋白在荧光显微镜下能发射绿色荧光，并且该蛋白还具有光氧化的特性，因此首先通过荧光显微镜选取表达IXSOG蛋白的细胞，之后再对该细胞进行光氧化操作，IXSOG因催化DAB产生了嗜锇颗粒，经锇酸固定染色后即可被电镜解析，从而实现了目标蛋白IX表达的光镜-电镜关联。

腺病毒IX蛋白具有转录因子活性，在病毒复制过程中参与调控病毒和细胞基因表达。作为结构蛋白，IX蛋白锚定六邻体结构，起到稳定病毒粒子的作用。免疫电镜结果显示，当野生型腺病毒Ad5感染细胞或IX蛋白在细胞内单独表达时，可在细胞核内形成包涵体，该包涵体在病毒感染后期能够“扣留”宿主细胞早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocytic leukaemia protein，PML)及Sp100蛋白[11]，从而有利于腺病毒的复制，除此之外，在IX形成的包涵体内还发现细胞双链RNA激活蛋白激酶PKR及细胞蛋白激酶CK2α的存在[15]。本研究中将IX与miniSOG融合表达，利用光镜-电镜关联方法，也在细胞核内观察到了IX蛋白表达形成的包涵体，表明我们建立的光镜-电镜关联方法的可行性。综上所述，我们成功建立了一种光镜-电镜关联方法，该方法可用于病毒蛋白在细胞内的定位研究。

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Study of intracellular location of adenovirus protein IX with correlative light and electron microscopy based on miniSOG

ZouXiaohui,ShaoBo,WangMin,QuJianguo,LuZhuozhuang,HongTao

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,StateKeyLaboratoryofInfectiousDiseasePreventionandControl,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,China(ZouXH,ShaoB,WangM,QuJG,LuZZ,HongT);HenanChemicalTechnicianCollege,Kaifeng475000,China(ShaoB)

LuZhuozhuang,Email:luzz@ivdc.chinacdc.cn

Objective To establish a method of correlative light and electron microscopy (CLEM) to study the intracellular location of adenovirus protein IX. Methods MiniSOG (mini singlet oxygen generator) is a recently-invented genetically-encoded tag for CLEM. MiniSOG-fused adenovirus IX gene (IXSOG) was cloned by PCR, and inserted into pcDNA3 plasmid to form pTPL-IXSOG, which was used to transfect 293 cells. IXSOG expressing cells could be distinguished under fluorescence microscope due to the emission of green fluorescence of miniSOG. The transfected cells were fixed in 2.5% glutaraldehyde in situ, stained with diaminobenzidine(DAB) through the photooxidation activity of miniSOG, and used to prepare ultrathin sections. Intracellular location of IXSOG was studied by observing the sections under transmission electron microscope. Results Eukaryotic expression plasmid carrying IXSOG fusion gene was constructed. IXSOG expressing cells were selected for DAB photooxidation and preparation of ultrathin sections. IXSOG fusion mainly formed punctate aggregations or inclusions in the nucleus. Conclusions The correlative light and electron microscopy method based on miniSOG was successfully established, and it could be used to study the intracellular localization of viral proteins.

MiniSOG; Protein IX; Photooxidation; Correlative light and electron microscopy

鲁茁壮，Email: luzz@ivdc.chinacdc.cn

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.002

MiniSOG；IX蛋白；光氧化；光镜-电镜关联技术

国家自然科学基金(31400156)；国家科技重大专项(2014ZX10004002-004)

2016-11-24)