王春花 黄威 周帅锋 于盼辉 段素霞 张益 高立冬 马学军

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(王春花、张益、马学军)；410005 长沙，湖南省疾病预防控制中心(黄威、周帅锋、高立冬)；050017 石家庄，河北医科大学(于盼辉、段素霞)

·论著·

1株与手足口病病原混合感染的札如病毒全基因组序列测定与分析

王春花 黄威 周帅锋 于盼辉 段素霞 张益 高立冬 马学军

102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(王春花、张益、马学军)；410005 长沙，湖南省疾病预防控制中心(黄威、周帅锋、高立冬)；050017 石家庄，河北医科大学(于盼辉、段素霞)

王春花、黄威为共同第一作者

目的 了解手足口病样本中除肠道病毒外的其他病毒病原，并分析其分子特征与基因类型。方法 采用宏基因组学结合生物信息学的方法对1例手足口病患儿样本进行深度测序分析。结果 该病例为肠道病毒71型与札如病毒混合感染。反转录聚合酶链反应(RT-PCR)验证样本中札如病毒核酸为阳性，经组装拼接获得全基因组序列为7 429 bp，含有3个开放阅读框。序列进化分析表明，该株病毒与浙江株Hu/G1/Zhejiang1/China/2014的同源性最高为99.4%，属于札如病毒GI基因型，是当前我国主要的感染型。结论 利用深度测序方法鉴定出手足口病样本混合感染病原为札如病毒，序列分析表明其为我国流行的优势毒株。该研究为今后我国手足口病和腹泻相关疾病的病原检测提供了参考依据,为了解我国札如病毒感染的分子特征提供了序列参考。

Fund programs: National Key Research and Development Plan (2016TFC1202700, 2016YFC120090)

札如病毒(Sapovirus, SaV)属于杯状病毒科的成员，与诺如病毒(Norovirus, NoV)一样，是非细菌性急性胃肠炎的主要病原体之一，可引起不同年龄段的人群发生腹泻，特别是5岁以下的儿童[1]。与诺如病毒相比，札如病毒引发的感染没有诺如病毒严重，暴发也不如诺如病毒常见，阳性率也比诺如病毒低，故以往有关札如病毒的报道和相关研究较少。另外，札如病毒可与其他病毒发生混合感染，如轮状病毒、星状病毒等肠道病毒[2-5]。

札如病毒基因组为单股正链RNA，基因组核酸序列全长约7.3-7.5 Kb，含有3个开放阅读框(Open Reading Frames, ORF)：ORF1、ORF2与ORF3，其中ORF1编码RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)和衣壳蛋白VP1。根据这两个蛋白区的基因序列多样性可将札如病毒分为GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ和GV 5个遗传组[6]。其中GⅠ和GⅤ组又可进一步分为8个和5个基因型[7]。近年来由札如病毒感染而引起的疫情在不断增加，研究发现该病毒感染在全球范围内分布较广，并且涵盖多种基因型[8-12]。因此，对札如病毒进行序列分析和基因型别鉴定，可为了解我国人群中札如病毒的流行趋势与病毒感染情况和监测病毒变异具有重要意义。本研究对1株与手足口病病原混合感染的札如病毒进行了全基因组序列的测定与分析，并对其病毒核酸进行了分子验证。

1 材料与方法

1.1 样本采集与处理 2015年11月份在湖南省某医院收集一名临床诊断为轻症手足口病的住院患儿粪便约10 g，立即冷冻至-20℃，然后低温运送至实验室待检测。在生物安全柜中取出黄豆粒大小粪便溶于无菌磷酸盐缓冲液(PBS)，经超声和离心后制备成20%的粪便悬液，分装成200 μl/管，保存于-80℃。

1.2 核酸酶消化与病毒核酸提取 取200 μl便悬液进行超速离心(32 000 r/min，3 h)，富集粪便样本中的病毒。用100 μl PBS重悬沉淀，加入核酸酶cocktail，37℃孵育90 min。核酸酶cocktail包含10U TURBOTMDNase (Ambion), 25U Benzonase® nuclease (Sigma), 5U DNase I (TaKaRa), 2 μg RNase A (TaKaRa), 5U RNase T1 (Thermo Scientic), 4 U RNase One (Promega), 4 U Micrococcal nuclease (New England Biolabs)和15 U Mung Bean nuclease (Promega)。然后根据Qiaamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)提供的实验操作步骤提取样本总RNA，分装后保存于-80℃。1.3 cDNA文库构建 将以上获得的总RNA利用SuperScript® Ⅲ Reverse Transcriptase kit (Invitrogen)联合半随机引物GGCAGGACCTCTGATACAGGNNNNNN，合成第一链cDNA。然后按文献[12]中的方法依次进行第二链cDNA合成和PCR扩增。

1.4 深度测序 纯化后的PCR产物以100 ng input按Ion Plus Fragment Library kit (Life Technologies)说明书构建测序文库，主要步骤为末端修复、接头连接、E-Gel片段筛选和qPCR定量。最后以26 pM文库进行油包水扩增、ES富集和Ion Torrent PGM测序仪测序。

1.5 深度测序数据分析 采用本实验室自主研发的病毒鉴定流程(Virus Identification Pipeline, VIP)[13]分析深度测序数据。使用CLC Genomic Workbench 9.0进行病毒序列拼接。

1.6 札如病毒的验证 按One-Step RT-PCR kit(Qiagen)说明书，用札如病毒特异性引物(SaV-F, 5′-CTCGCCACCTACRAWGCBTGGTT-3′,SaV-R, 5′-CGGRCYTCAAAVSTACCBCCCCA-3′)[14]检测样本核酸。

1.7 系统进化分析 从GenBank下载目前已有的札如病毒全基因组序列或参考株的基因序列，进行多序列比对分析。采用MEGA5.0软件[15]和邻接法(Neighbor-Joining)进行系统进化分析，并用Bootstrap重复抽样1 000次对进化树进行验证。

2 结果

2.1 深度测序数据概述 经去除多克隆和低质量数据，本研究共获得66 266条reads,平均测序读长为151 bp。经VIP分析，结果显示病毒相关reads所占比例为29.5%。部分序列匹配到了肠道病毒71型和札如病毒且平均覆盖度为99.9%和100%(图1)，提示样本中存在肠道病毒71型和札如病毒核酸，该手足口病患儿可能为肠道病毒71型和札如病毒混合感染。

图1 肠道病毒71型与札如病毒的基因组覆盖度和测序深度分析Fig.1 Viral genome coverage and sequencing depth analysis for enterovirus A71 and sapovirus

2.2 RT-PCR验证 用札如病毒特异性引物对样本核酸进行RT-PCR检测，琼脂糖电泳扩增产物，结果显示样本核酸泳道有434 bp的目标条带。将该产物送公司进行Sanger法测序，序列分析表明该样本为札如病毒阳性。

图2 札如病毒VP1基因(A)和全基因组(B)核苷酸序列的遗传进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the nucleotide sequence in VP 1 gene (A) and complete genome (B) of sapovirus.

2.3 札如病毒核酸序列分析 将深度测序数据进行组装拼接，获得札如病毒全基因组序列，命名为SapovirusHu/GI/Hunan/China/2016，并将其全长序列采用Sequin完成序列注释和生成测序提交文件后上传GenBank，获得序列登录号为KX980412。全基因组序列分析表明：该株病毒基因组全长7 429 bp，包含3个ORF，其中ORF1编码VP1蛋白。GC含量为50.81%，各碱基比例为：A(25.6%)、C(25.7%)、G(25.1%)、T(23.6%)。经与GenBank中现有的札如病毒全基因组序列进行多序列比对分析，结果显示Sapovirus Hu/GI/Hunan/China/2016与GenBank中唯一的中国人源札如病毒Hu/G1/Zhejiang1/China/2014(KT327081)的同源性最高，核苷酸序列一致性为99.4%，氨基酸序列一致性为99.5%。

2.4 系统进化树分析 从GenBank中下载札如病毒VP1基因的代表性序列和札如病毒全基因组的代表性序列，与本研究获得的病毒株相关序列进行多序列比对分析，构建系统进化树。如图2所示，基于VP1基因(1 686 bp)和基于全基因组序列构建的进化树，Sapovirus Hu/GI/Hunan/China/2016与其他代表株聚集为GI-GV 5个分支，并且均与Hu/G1/Zhejiang1/China/2014(KT327081)处于同一个遗传进化分支，表明该株病毒与Hu/G1/Zhejiang1/China/2014(KT327081)距离最近，同属于GI基因型。

3 讨论

本研究采用宏基因组学方法对一例手足口病轻症患者的粪便样本进行了深度测序分析，结果表明该患者为肠道病毒71型与札如病毒混合感染。自1976年首次在日本扎幌市的一次暴发性腹泻中发现该病毒以来，札如病毒与其他病毒混合感染的情况在世界范围内较为常见。我国在札如病毒阳性样本中检测到了轮状病毒和星状病毒，混合感染率为20%。王颜歌等[16]在札如病毒阳性样本中分别检测到了轮状病毒、星状病毒和诺如病毒，构成比为18.75%。Wang等[17]在日本急性肠胃炎婴儿和儿童的粪便样本中也检测到了札如病毒与轮状病毒的混合感染，混合感染率为11.76%。近期有研究报道，札如病毒与诺如病毒的不同型别存在双重感染或三重感染，并且此类混合感染主要为海鲜类食源性引发[18-20]。据我们所知，目前已报道的混合感染均来自于急性肠胃炎病例，并且均为札如病毒与腹泻相关病毒共感染的现象。本研究首次在手足口病病例中发现了手足口病病原与札如病毒共感染的情况，为以后手足口病和腹泻相关疾病的病原检测提供了参考依据。

本研究还对混合感染的札如病毒序列进行了组装和拼接，获得了7 429 bp全长基因组序列。并将该基因组序列与GenBank中现存的参考株全序进行了多序列比对和系统发育分析。结果显示，无论核苷酸序列还是氨基酸序列，Hu/GI/Hunan/China/2016与札如病毒浙江株[21]的同源性最高；无论是基于VP1基因序列还是基于基因组全长序列构建的进化树，Hu/GI/Hunan/China/2016与札如病毒浙江株均位于相同的进化分支。序列分析与进化树均表明Hu/GI/Hunan/China/2016为札如病毒GI型，与国内多个地区流行的型别相同。我国深圳、海南、广西、吉林、上海、陕西、浙江等地，札如病毒GI型是流行的优势毒株[4,16,20]。除GI型外，深圳等地区还报道了札如病毒GII型、GIV型。可见，札如病毒的流行具有多样性。因此，本研究对札如病毒的序列进行分析和型别鉴定对该病毒的诊断、监测和防控具有重要意义。

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Complete genome analysis of a sapovirus in a mixed infected patient of hand foot and mouth disease

WangChunhua,HuangWei,ZhouShuaifeng,YuPanhui,DuanSuxia,ZhangYi,GaoLidong,MaXuejue

NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(WangCH,ZhangY,MaXJ);HunanProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Changsha410005,China(HuangW,ZhouSF,GaoLD);HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China(YuPH,DuanSX)WangChunhuaandHuangWeiarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticle

MaXuejun,Email:maxj@ivdc.chinacdc.cn;GaoLidong,Email: 810173358@qq.com

Objective To understand the potential viral pathogens other than enteroviruses existing in samples of hand foot and mouth disease (HFMD) patient and study their molecular feature and genotype. Methods The deep sequencing analysis of a fecal specimen collected from HFMD patient was conducted by metagenomics and bioinformatics. Results Enterovirus A71 and sapovirus mixed infection was found in this case. The nucleic acid of sapovirus was confirmed positive by RT-PCR and the 7 429 bp complete genome sequence of sapovirus was obtained by assembling sequencing reads which consisted of 3 open reading frames. Phylogenetic analysis revealed that this strain of virus should belong to the genotype 1 of sapovirus having a homology of 99.4% with sapovirus Hu/G1/Zhejiang1/China/2014 strain, which is a currently predominant genotype circulating in China. Conclusions The sapovirus, which is a predominant strain circulating in China, was a mixed infected causative agent existing in HFMD sample identified by deep sequencing. This study will serve as a reference for pathogen detection of HFMD and diarrheal related diseases, as well as provide a sequence reference for molecular feature study of sapovirus in China in the future.

Sapovirus; Deep sequencing; Complete genome sequence; Phylogenetic analysis

国家重点研发计划(2016TFC1202700，2016YFC1200900)

马学军，Email: maxj@ivdc.chinacdc.cn；高立冬，Email: 810173358@qq.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.011

札如病毒；深度测序；全基因组序列；进化分析

2016-05-11)