张仁庆 孙静 马月 杨晓东 吕燕 徐小峰 陈志宝 董小平 肖莉杰 陈操

163000 大庆，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院(张仁庆、陈志宝、肖莉杰);102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室(张仁庆、孙静、马月、杨晓东、吕燕、徐小峰、董小平、陈操)

·论著·

羊瘙痒因子139A感染小鼠脑组织中CaM信号通路变化的研究

张仁庆 孙静 马月 杨晓东 吕燕 徐小峰 陈志宝 董小平 肖莉杰 陈操

163000 大庆，黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院(张仁庆、陈志宝、肖莉杰);102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,传染病预防控制国家重点实验室(张仁庆、孙静、马月、杨晓东、吕燕、徐小峰、董小平、陈操)

目的 分析CaM及其下游信号分子在羊瘙痒因子感染小鼠模型脑组织中的变化特点。方法 利用Western blot及免疫组织化学方法检测羊瘙痒因子感染小鼠脑组织中CaM表达变化、分布特点及下游相关激酶及调控蛋白的表达变化。结果 在羊瘙痒因子139A感染小鼠终末期脑组织中CaM的表达较正常对照小鼠明显上调且主要分布于139A感染小鼠的皮层、丘脑和小脑区域。在羊瘙痒因子139A感染小鼠终末期脑组织中下游激酶CaMKII、磷酸化的CaMKII(p-CaMKII)及p-CaMKIV表达水平增加。CaMKs的下游调控蛋白cAMP调控元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)及其磷酸化形式(p-CREB)均呈上调趋势，而其下游调控蛋白脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)表达则明显下调。结论 神经元内朊病毒的复制可能影响了BDNF的合成，从而使其降低了对神经元的保护作用。

Fund programs: National Natural Science Foundation of China (81401670, 81630062); Young Scholar Scientific Research Foundation of China CDC (2016A101); SKLID Development Grant (2012SKLID102, 2016SKLID603); Graduate Research and Innovation Projects of Heilongjiang Bayi Agricultural University(YJSCX2016-Y48)

朊病毒病(Prion disease)，又称可传播性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies, TSE)，是一类侵袭人和动物中枢神经系统致死性疾病，潜伏期长，致死率100%[1]。目前的研究认为朊病毒病的感染因子是一种不含核酸，能自我复制具有感染性的蛋白质—朊病毒，可将存在于细胞表面、对蛋白酶敏感的细胞型朊蛋白(Cellular prionprotein，PrPC)转变为异常的、对蛋白酶具有部分抵抗作用的羊瘙痒因子样朊蛋白(Scrapie-like prion protein，PrPSc)。在转变为PrPSc后，PrPC本身具有的生理作用如免疫调节、信号转导、铜离子结合等将会受到破坏。

Ca2+是中枢神经系统内重要的第二信使，在细胞内通过与钙调蛋白(Calmodulin，CaM)结合发挥多种生理作用，如细胞增殖、凋亡及自噬等[2-5]。当细胞受到外界的有效刺激后，细胞内的Ca2+浓度瞬时提高，Ca2+即与CaM结合[6, 7]，导致CaM构象改变，生成有活性的Ca2+/CaM复合物[8]。Ca2+/CaM复合物会通过活化依赖Ca2+/CaM的蛋白激酶(CaMK)，再进一步影响如cAMP调控元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)等靶酶的活性，从而完成诸多生理作用[9]。

本研究以羊瘙痒因子感染的小鼠为研究对象，检测了CaM及其下游激酶和调控蛋白的表达水平，了解了朊病毒感染导致CaM及其下游底物含量变化特点，为明确朊病毒病的致病机制奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 脑组织匀浆的制备 取正常C57BL/6小鼠及羊瘙痒因子感染小鼠终末期脑组织，用裂解液(100 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA, 0.5% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 10 mmol/L Tris, pH 7.5含蛋白酶抑制剂)制成10%(w/v)的脑匀浆，2 000 g离心10 min后取上清分装，-80℃保存备用。

1.2 Western blot检测 将蛋白样品变性处理之后上样至12% SDS-PAGE电泳，半干转移至NC膜，1 h封闭，一抗孵育4℃过夜，所用一抗种类及稀释度如下，CaM多抗(1∶100稀释)、CaMKII单抗(1∶500稀释)、p-CaMKII(T286)多抗(1∶1 000稀释)、CaMKIV多抗(1∶5 000稀释)、p-CaMKIV(T196+T200)多抗(1∶1 000,稀释)、CREB单抗(1∶5 000稀释)、p-CREB(S133)单抗(1∶5 000稀释)、脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)多抗(1∶5 000稀释)。二抗为HRP标记的抗鼠及抗兔IgG抗体。ECL显色，使用Image J软件进行定量分析。

1.3 统计学方法 数据用均数加减平均标准差表示，两组间差异用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义，P>0.05为无意义。

2 结果

2.1 羊瘙痒因子139A感染小鼠终末期脑组织中CaM的表达水平 分别取用3只羊瘙痒因子小鼠适应株139A感染终末期小鼠脑组织匀浆和3只正常C57BL/6小鼠脑匀浆，利用Western blot方法检测CaM的表达水平。结果显示，与3只正常C57BL/6小鼠相比，3只感染羊瘙痒因子139A终末期的小鼠脑组织中CaM的表达水平明显增加(图1A)。相对灰度值分析结果显示，139A感染小鼠终末期脑组织中CaM的表达水平明显高于正常小鼠，差异具有显著统计学意义(图1B)。

为了探究CaM在朊病毒感染后脑组织中的分布情况，分别选取3只139A感染终末期小鼠及3只正常对照C57BL/6小鼠脑组织切片进行CaM特异性免疫组织化学检测，结果显示在139A感染小鼠脑组织的皮层、丘脑和小脑区域发现大量CaM特异性棕色斑点(图2)，提示在这些脑区中CaM的含量较高。

2.2 羊瘙痒因子139A感染小鼠终末期脑组织中CaMKⅡ 和CaMKⅣ表达特点 CaMKII 和CaMKIV是Ca2+/CaM下游两个重要的激酶[5]。为了评估在朊病毒感染后CaM下游激酶的表达特点，我们利用Western blot的方法检测了139A感染终末期小鼠脑组织中CaM下游激酶CaMKII以及CaMKⅣ的表达水平。与正常小鼠对比，139A感染终末期小鼠脑组织中CaMKII的含量整体呈增加趋势(图3A)，具体为CaMKIIα含量增加具有统计学意义，而尽管p-CaMKIIα(Thr286)和CaMKIIβ含量增加，但无统计学意义(图3B)。而另一种钙调蛋白激酶CaMKⅣ在139A感染小鼠终末期脑组织中的表达含量较正常小鼠明显下调，p-CaMKⅣ(Thr196,200)表达水平明显上调，具有统计学意义(图3C和3D)。这些结果提示羊瘙痒因子感染终末期小鼠脑组织中CaM含量的增加很可能加速促进了下游激酶的自身磷酸化。

A. Western blot结果；B. 灰度值量化分析结果图1 羊瘙痒因子139A感染小鼠终末期脑组织中CaM的表达水平A, CaM-specific Western blot. B, Densitometric analysis of the average gray value of the CaM in brains of scrapie agent 139A infected mice Fig.1 Comparative analysis of the alterations of CaM levels in the brain homogenates of scrapie agent 139A infected mice collected at terminal stage

注：黑色实心箭头标记CaM特异性染色

2.3 羊瘙痒因子139A感染小鼠终末期脑组织中CREB 和BDNF表达水平的变化 为了进一步探究CaM激酶活化后对后续细胞调控蛋白的影响，我们通过Western blot方法对羊瘙痒因子139A感染小鼠终末期脑组织中CaMK下游的调控蛋白CREB及其活化形式p-CREB的含量进行了检测。结果显示，与正常小鼠相比，139A感染终末期小鼠脑组织中CREB及p-CREB(Ser133)的表达上调，且具有统计学意义。但值得注意的是，受CREB调控的BDNF的表达水平在139A感染终末期小鼠脑组织中呈下调的趋势(图4A和4B)。

3 讨论

CaM是一种广泛分布在真核细胞中的Ca2+结合蛋白，可介导许多信号通路[2-4]。CaM跟Ca2+结合后其自身构象将发生变化，这有利于与下游靶蛋白的结合，所形成的Ca2+/CaM复合物在中枢神经系统的学习记忆形成与维持方面扮演着重要的角色[5]，同时参与了众多生理调节过程，如细胞迁移、增值、凋亡、自噬磷酸化/去磷酸化蛋白及细胞骨架形成等。因此，疾病引起的CaM表达水平异常增高将会干扰细胞内Ca2+稳态以及影响许多下游生理功能。有研究报道阿尔兹海默氏病(Alzheimer’s disease，AD)患者细胞中CaM表达水平明显升高，而且在散发和家族型AD患者细胞内发现Ca2+稳态异常[10, 11]。我们在蛋白质组学研究中也发现散发型克-雅病(Sporadic CJD，sCJD，一种人类的朊病毒病)患者脑组织皮层区和脑脊液中CaM水平异常升高[12, 13]。这些结果在本研究的动物模型脑组织中得到了验证，强烈提示sCJD患者脑组织中CaM的表达可能也是上调的，同时渗透至脑脊液中从而引起脑脊液中CaM的异常升高。

A和C:Western blot结果；B和D:灰度值量化分析结果图3 羊瘙痒因子139A感染小鼠终末期脑组织中CaMKs的表达水平A and C, Western blots analysis. B and D, Densitometric analysis of the average gray value of each CaMKsFig.3 Alterations of CaMKs in the brain homogenates of 139A-infected mice at the end stage of disease

A. Western blot结果；B. 灰度值量化分析结果图4 羊瘙痒因子139A感染小鼠终末期脑组织中CaM通路相关调控蛋白CREB，p-CREB及BDNF的表达水平A, Western blots analysis. B, Densitometric analysis of the average gray value of CREB, p-CREB and BDNFFig.4 Comparative analysis of the alterations of CaMKs-related downstream substrates CREB, p-CREB and BDNF in the brain homogenates of 139A-infected mice at the end stage of disease

CaM最为重要的靶蛋白就是CaMKs，而CaMKⅡ和CaMKⅣ是其中重要的两位成员。CaMKⅡ是一种兴奋性突触后的重要蛋白，而CaMKⅡα和CaMKⅡβ是其含量最为丰富的两种亚基，其中CaMKⅡα对突触可塑性和记忆形成具有重要的作用[14, 15]，而CaMKⅡβ的主要作用是维持CaMKⅡ结构的完整性[16]。CaMKⅣ是神经元生存的重要蛋白，它主要通过磷酸化CREB来发挥生理调节功能，从而维持神经元的生存。有研究表明过表达CaMKⅣ将会减少小脑颗粒神经元的凋亡[17]。 本研究中我们发现CaMKⅡ和CaMKⅣ及其磷酸化形式整体呈现上调的趋势，提示升高的CaM在一定程度上发挥了自身的活性，能够使下游的CaMKs发生自身磷酸化，从而作用于靶蛋白。但是在我们同时进行的羊瘙痒因子263K感染仓鼠终末期脑组织的研究中则发现了相反的情况，即CaMKs及其下游底物呈现了完全被抑制的情况，这种差别是否是由于种属或者毒株差异造成的还有待进一步研究。

本研究发现CaMKs的下游底物——CREB及其活化形式p-CREB的含量明显升高，这可能主要得力于其上游激酶的活化，即p-CaMKIV含量的增加。体内[18]和体外[19]实验证明BDNF在神经元分化和生存方面具有重要的保护作用。成年大鼠脑中受损伤区域BDNF的mRNA表达增加[20]，同时在AD患者尸检脑组织的海马区域检测到BDNF的mRNA表达明显减少[21]。但本研究的结果显示，虽然p-CREB的表达上调，但其对BDNF的调控能力却明显减弱，我们之前的研究发现在朊病毒感染患者脑组织转录谱中BDNF的转录水平明显下降[22]。提示朊病毒感染过程中可能存在其他因子抑制BDNF的转录，近期研究发现使BDNF发挥作用两种结合蛋白TrkB/p-TrkB和p75NTR的含量在朊病毒感染终末期脑组织中含量明显降低[23]，这很可能是引起BDNF含量降低的另一个原因。

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Alterations of CaM pathway in the brains of scrapie infected mice

ZhangRenqing,SunJing,MaYue,YangXiaodong,LyuYan,XuXiaofeng,ChenZhibao,DongXiaoping,XiaoLijie,ChenCao

CollegeofLifeScienceandTechnology,HeilongjiangBayiAgricultureUniversity,Daqing163000,China(ZhangRQ,ChenZB,XiaoLJ);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention，StateKeyLaboratoryforCommunicableDiseasePreventionandControl，ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention，Beijing102206，China(ZhangRQ,SunJ,MaY,YangXD,LyuY,XuXF,DongXP,ChenC)

XiaoLijie,Email:xlj2061@126.com;ChenCao,Email: 4825764@sina.com

Objective To analysis the alterations of CaM and its downstream factors in the brains of scrapie infected mice. Methods Using the methods of Western blot and immunohistochemistry assay to detect the levels and distributions of CaM, as well as the expressing alterations of the downstream substrates of CaM in the brains of mice infected with scrapie. Results Compared with the normal controls, the levels of CaM are significantly increased in the brains of scrapie-infected mice and particularly distributing in the regions of cortex, thamalus and cerebellum. Remarkable high levels of CaMKII, p-CaMKII and p-CaMKIV are observed in the brain homogenates of scrapie-infected mice. The regulatory protein of cAMP response element binding protein (CREB) and p-CERB are also increased, while the levels of BDNF which is regulated by p-CREB are obeviously downregulated. Conclusions The synthesis of BDNF may be influenced by the prion replication in neuron and further attenuates its neuronal protective features.

Prion diseases；Calmodulin；Ca2+/Calmodulin-dependent binding protein

肖莉杰，Email：xlj2061@126.com；陈操，Email：4825764@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.01.003

朊病毒病；钙调蛋白；钙调蛋白激酶

国家自然科学基金(81401670；81630062)；中国疾病预防控制中心青年科研基金(2016A101)；传染病预防控制国家重点实验室(2012SKLID102；2016SKLID603)；黑龙江八一农垦大学研究生创新项目(YJSCX2016-Y48)

2017-01-03)