郭跃跃,杜站宇.2,宋兴超,史 赫,吴 琼,邢秀梅,赵家平*,徐 超*

(1.中国农业科学院特产研究所/农业部特种经济动物遗传育种与繁殖重点实验室/吉林省特种经济动物分子生物学省部共建国家重点实验室,吉林长春 130112; 2.吉林农业大学，吉林长春 130118；3.长春百克生物科技股份公司,吉林长春 130012)

酪氨酸酶转运对黑色素生成影响研究进展

郭跃跃1,杜站宇1.2,宋兴超1,史 赫3,吴 琼1,邢秀梅1,赵家平1*,徐 超1*

(1.中国农业科学院特产研究所/农业部特种经济动物遗传育种与繁殖重点实验室/吉林省特种经济动物分子生物学省部共建国家重点实验室,吉林长春 130112; 2.吉林农业大学，吉林长春 130118；3.长春百克生物科技股份公司,吉林长春 130012)

哺乳动物毛色的形成依赖于黑色素细胞中黑色素数量及分布比例，酪氨酸酶类(TYR/TYRP1)的转运及其活性是黑色素合成的关键。衔接蛋白(AP-1/3)和溶酶体相关细胞器生物合成复合物(BLOC-1, 2, 3)将TYR/TYRP1从早期核内体转运至黑素小体，若TYR/TYRP1无法转运至黑素小体中，黑色素合成则会受到抑制。ATP7A将铜离子转移到TYR/TYRP1，从而激活TYR/TYRP1活性，ATP7A的减少同样会使黑色素细胞中黑色素合成量减少。关注这些复合物在转运TYR/TYRP1的作用及影响其活性的因素，可以从不同的角度解析黑色素合成机理，以此为基础探索哺乳动物毛色的淡化机制，以期为阐明人类黑色素合成障碍的相关疾病提供理论依据。

黑色素细胞；黑色素；酪氨酸酶类；转运；活性

黑色素是一种本质为蛋白质的高分子生物复合色素，为不溶于水和几乎所有溶剂的无定型小颗粒，通常以聚合物的形式存在于动物皮肤或者毛发中，其含量和分布会直接影响皮肤、头发和眼睛的颜色。黑色素主要存在于黑色素细胞中，哺乳动物的毛色主要是由黑色素的组成、数量与分布情况决定的。一般情况下，黑色素细胞的大小和数量是恒定的，所以毛色主要取决于黑色素的组成、数量和分布情况。

总结前人的研究结果，本文对黑色素的生成和酪氨酸酶进行简要介绍，围绕溶酶体相关细胞器生物合成复合物(biogenesis of lysosome-related organelles complex，BLOC)和AP复合物对TYR和TYRP1的转运机理和影响其活性的因素，揭示TYR和TYRP1在黑色素生成过程中的作用，希望能对动物毛色遗传机制的研究提供思路。

1 黑色素的生成

黑色素包括褐黑色素和真黑色素，褐黑色素为溶于碱的红色圆形颗粒，含有硫原子，外在表现为黄色或微红棕色；真黑色素为典型的生物黑色素，不含有硫原子，外在表现形式为棕色或黑色，真黑色素比褐黑色素难溶。哺乳动物的毛色就是由黑色素细胞产生的这两种不同类型的黑色素，即真黑色素和褐黑色素的分布和二者的比例决定的。在酪氨酸酶的催化作用下，酪氨酸被氧化为多巴醌；多巴醌自动氧化生成多巴和多巴色素，多巴也是酪氨酸酶的底物，它被催化后再次生成多巴醌；多巴色素的反应产物5，6-二羟基吲哚(DHI)和5，6-二羟基吲哚羧酸(DHICA)经一系列的氧化反应生成真黑素，其为皮肤的色素主要组分；在半胱氨酸或者谷胱甘肽存在的条件下，多巴醌会转变成半胱氨酰多巴，最后生成褐黑色素[1]。酪氨酸酶在黑色素的合成过程中起着非常重要的作用，合成的黑色素没有固定的分子质量；黑色素不断产生和沉积并形成均匀的黑色素颗粒，成熟的黑色素颗粒沿着微管、微丝运动到黑色素细胞的树突上，再到达相邻的角质细胞中，最后被角质细胞内的溶酶体降解，随表皮细胞的脱落而排出[2]。

2 酪氨酸酶

酪氨酸酶又称多酚氧化酶,是一种约75 ku含铜的氧化还原酶，广泛存在于动植物、微生物及人体中,是黑色素合成的限速酶,直接影响黑色素的合成。酪氨酸酶由多个亚基组成，每个亚基含有2个金属铜离子，而2个铜离子分别与3个组氨酸残基的亚氨基共价结合固定在活性中心上，另外有1个内源桥基将2个铜离子联系在一起，构成酪氨酸酶的活性中心[3]。如果铜被氧化，酶就会失活并且可以通过电子供体被重新激活，例如L-3, 4二羟苯丙氨酸、抗坏血酸、超氧阴离子，以及可能的一氧化氮。在植物中，酪氨酸酶为多酚氧化酶；在昆虫中则称为酚氧化酶；在微生物和人体中，才称为酪氨酸酶。酪氨酸酶基因家族在催化黑色素生成时产生作用的共有3种，即TYR、TYRP1和TYRP2，其中TYRP1和TYRP2在控制黑色素细胞产生黑色素类型的最后几步中起催化作用，TYR是在黑色素合成起始过程中的一种关键的限速酶，至少具有酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶两种活性，在黑色素合成过程中涉及到酪氨酸酶的氧化以及转运。酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴，再经过一系列的步骤最终生成黑色素。黑色素使动物呈现较暗颜色，特别是黑色和棕色，有时出现黄色。酪氨酸酶的表达和活性决定着黑色素生成的速度和产量，酪氨酸酶活性越高，皮肤中黑色素形成的量就越多[4]。

3 酪氨酸酶的转运

黑素小体是真核生物细胞中用于合成和沉积黑色素的唯一溶酶体相关细胞器(lysosome-related organelles, LROs)[5]，基因变异使LROs生物合成紊乱，结果导致视觉、皮肤和毛发色素沉积、血液凝结和肝功能损坏等症状都被称为Hermansky-Pudlak综合征(Hermansky-Pudlak syndrome，HPS)[6]。成熟的黑素小体在生物合成过程中，需要TYR和TYRP1从早期核内体转运到黑素小体，它们的缺失将直接导致HPS[6]。引起HPS的基因至少有10种，这些基因参与编码了4种细胞质多亚基蛋白复合物，即衔接蛋白(adaptor protein-3，AP-3)和BLOC-1、2、3[7]。黑素小体的成熟过程分为四个阶段，在第二阶段末期，酪氨酸酶类(tyrosinase,TYR;tyrosinase-related protein-1,TYRP1;DOPAchrometautomerase,DCT)被转运进入黑素小体[8]， Raposo G和Marks MS指出,由于AP-3和BLOC1/2/3复合物对TYR和TYRP1的分选作用才使它们成功转运到达黑素小体[9]。

3.1 BLOC-1/2/3

BLOC-1定位于核内体小管(endosomal tubules)，由8个蛋白亚基所组成，是具有弯曲结构的结合蛋白复合物[10]，其中2个基因所编码的蛋白突变可以导致人类HPS的发生，其他基因所编码的蛋白突变可以导致鼠的HPS[7]。大多数小鼠色素减退的HPS模型是由于BLOC-1突变，从而导致视网膜色素上皮细胞、脉络膜和皮肤中黑素小体的减少[7]。Delevoye C等[11]的研究表明，BLOC-1通过促进分选核内体(sorting endosomes)小管(tubules)的延长和剪切作用形成循环核内体(recycling endosome，RE)，BLOC-1再联合微管蛋白(KIF13A)和肌动蛋白(annexinA2)形成AnnexinA2-BLOC-1-KIF13A网络，参与循环融合机制，将TYRP1转运到黑素小体。在BLOC-1突变的黑色素细胞中，TYRP1从早期核内体到黑素小体的过程中由于内吞噬作用变得不稳定，大量TYRP1聚集在早期核内体囊泡和细胞表面而不能达到黑素小体，最终导致色素大量减少[6]。

BLOC-2定位于核内体小管，由HPS3、HPS5、HPS6 3种蛋白亚基组成，在人和小鼠上都发现了对应的HPS并且在小鼠中建立了模型，相对于BLOC-1突变，缺失BLOC-2的小鼠色素淡化的症状较轻[7]。在缺失BLOC-2的小鼠黑色素细胞中，大量TYRP1聚集在核内体泡中，黑素小体内TYRP1的数量要明显少于TYR，而BLOC-1缺失细胞中在核内体泡的下游发现大量TYRP1，在功能上，BLOC-1和BLOC-2的作用都是将TYRP1从早期核内体转运到黑素小体[12]，观察BLOC-1缺失细胞和BLOC-2缺失细胞的表型，可以发现BLOC-1是在核内体出芽时期对TYRP1进行分拣，而BLOC-2的缺失细胞中，大量TYRP1都聚集在核内体囊泡，并且因为BLOC-2的缺失，核内体小管变短、变少、与黑素小体接触的频率也降低[13]，游离在核内体之外的TYRP1被溶酶体降解，这说明BLOC-2的作用是指导核内体循环小管转运中间物质到达黑素小体从而促进酪氨酸酶的转运和色素沉积[13]。

BLOC-3由HPS1和HPS4两种蛋白亚基组成，并发现了对应的小鼠HPS模型[7]，HPS1病人的黑色素细胞中自我吞噬作用增强，并且吞噬囊泡都聚集在黑素小体附近[14]。Gerondopoulos A等[15]指出BLOC-3是Rab32和Rab38的鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)，Rab32和Rab38参与黑色素合成过程中的转运，在Rab32/38缺失细胞中，TYR和TYRP1从反面高尔基体(trans-Golgi network，TGN)合成后被降解，而不能到达黑素小体[16]。因为BLOC-3的缺失，Rab32和Rab38的协同效果降低，导致TYR和TYRP1从早期核内体到黑素小体的过程变得不稳定，从而被聚集在黑素小体附近的吞噬囊泡吞噬才导致黑色素合成受阻。TYR/TYRP1从核内体出来后要进入黑素小体就需要与黑素小体的膜融合，介导这一融合过程的是附着蛋白受体(soluble NSF attachment protein receptor，SNARE)，其中一种膜囊泡蛋白(vesicle-associated membrane protein 7，VAMP7)[17]作为SNAREs的一种与黑素小体生物合成相关，Rab32/38作用的发挥需要与VAMP7结合。Dennis M K等[18]的研究指出，是VAMP7介导了BLOC-1与黑素小体的融合过程，促使了TYR/TYRP1到达黑素小体，且这一过程离不开BLOC-3的辅助作用，从这一角度也可以区分HPS突变中由于BLOC-1和BLOC-3的缺陷所产生的色素淡化表型。

3.2 AP

衔接蛋白复合物(adaptor protein complexes，AP-1/2/3/4)是细胞器的组分，既可以形成载体的囊泡，也可以招募货物到新的囊泡，其中AP-1和AP-3与黑色素的生物合成相关，人的AP-3蛋白亚基突变被确定为HPS2型，在小鼠上是pearl和mocha突变[19]。Huizing M等[20]培养HPS2缺失的黑色素细胞后，发现正常和HPS2缺失的黑色素细胞中都存在TYRP1，认为TYRP1的转运与AP-3无关。Theos A C等[21]的研究表明,AP-3和AP-1的功能是将TYR从核内体转运至黑素小体，且这两种复合物可以独立地识别黑色素细胞中的TYR。缺失AP-3的细胞中，TYR仍存在于晚期核内体和多囊泡体中，游离在外部的囊泡中缺少TYR，Huizing M等[20]认为AP-3可能是在多囊泡体上用于形成包含有TYR的囊泡，并最终与前黑素小体融合。Delevoye C等[22]减少黑色素细胞中AP-1或KIF13A的数量后，循环核内体的数量被重新分配，TYRP1被隔离在黑素小体之外，导致黑色素的合成和黑素小体的成熟都受到了限制。AP-1覆盖在核内体管上，与黑素小体连接，联合KIF13A促进核内体小管并沿着微管小体向黑素小体延长，使核内体管可以与黑素小体融合后将货物转运到黑素小体。

4 ATP7A对酪氨酸酶的影响

ATP7A，是一种跨膜蛋白，借助ATP水解产生的能量穿过细胞膜运输铜离子[23]。铜离子在所有的细胞中都很重要，但是作为TYR的酶辅助因子在脊椎动物的黑色素生物合成过程中尤为重要，将TYR上两个铜离子绑定位点切除后，都将使酶活性丢失并导致眼皮肤白化病[24]。黑色素的生物合成只发生在黑素小体上，但是TYR需要从TGN获得铜离子，而后才被分泌到黑素小体，激活TYR活性的铜离子是由ATP7A提供的[23]，缺失ATP7A的小鼠会严重导致色素淡化[25]。Setty S R等[26]在用免疫荧光显微镜下对野生黑色素细胞系进行观察后发现，在黑色素细胞的成熟黑素小体周围有98%的ATP7A，而在BLOC-1突变的黑色素细胞中，黑素小体周围ATP7A很少，推测ATP7A的定位需要BLOC-1的参与，而BLOC-1缺失细胞中TYR在无色素积累的黑素小体中没有活性，可能是因为BLOC-1缺失细胞中没有ATP7A，从而没有可用于激活TYR的铜离子，所以最终导致TYR没有活性。

除了这一影响因素外，黑素小体内的离子环境也对酪氨酸酶活性有影响，SLC24A5[27]、SLC45A2[28]和OCA2[29]都是黑素小体膜上的离子泵，他们共同参与调节了黑素小体内的离子平衡，如果其中之一突变将使黑素小体内离子种类和数量不平衡，这也会影响铜离子数量，从而影响酪氨酸酶活性。酪氨酸酶在中性pH下发挥最佳活性[30]，离子环境不平衡也可能导致黑素小体内pH的改变，影响酪氨酸酶发挥作用的最佳条件，最终使黑色素合成减少。

5 展望

哺乳动物毛色的形成主要依赖于黑色素细胞中黑色素的合成，酪氨酸酶类(TYR、TYRP1)的转运及其活性是黑色素合成的关键。BLOC-1/2/3、AP-3分别将TYR和TYRP1从早期核内体转运至黑素小体中，AP-1的作用是稳定这一转运过程。如果组成BLOC-1/2/3或AP-1/3的蛋白亚基突变，大量的TYR/TYRP1会无法转运至黑素小体中，黑色素的合成会受到严重限制，会使黑色素细胞中黑色素合成量减少，最终导致动物毛色淡化甚至全身白化。BLOC-1/2/3或AP-1/3的蛋白亚基突变不仅仅影响黑色素的合成，还有其他一系列的综合征，在小鼠和人上属于HPS。酪氨酸酶的活性中心与铜离子相关联，有研究表明，ATP7A提供铜离子给酪氨酸酶，且BLOC-1缺失细胞中发现大量酪氨酸酶都缺少活性，使进入黑素小体的酪氨酸酶则无法参与黑色素的合成，产生的黑色素减少，从而导致动物色素淡化的表型。

哺乳动物毛发颜色的淡化原因多种多样，BLOC-1/2/3和AP-1/3复合物是转运酪氨酸酶类的载体，关注这些复合物在转运酪氨酸酶类的作用和影响酪氨酸酶类活性的因素，可以从不同的角度理解黑色素的生物合成，以此为基础探索哺乳动物毛色的淡化机制，以期为人类阐明黑色素合成障碍的相关疾病提供参考。

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Advance in Effects of Transport of Tyrosinase Family on Melanin Biosynthesis

GUO Yue-yue1,DU Zhan-yu1,2,SONG Xing-chao1,SHI He3,WU Qiong1, XING Xiu-mei1,ZHAO Jia-ping1,XU Chao1

(1.KeyLaboratoryofSpecialEconomicAnimalGeneticBreedingandReproduction，MinistryofAgriculture，StateKeyLaboratoryofSpecialEconomicAnimalMolecularBiology，InstituteofSpecialAnimalandPlantScienceofCAAS，Changchun,Jilin,130112，China;2.JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin,130118,China; 3.ChangchunBCHTBiotechnologyCo.,Changchun,Jilin,130012,China)

The formation of the mammalian coat color is mainly dependent on the melanin synthesis in melanocytes.The transport and activities of tyrosine enzymes (TYR,TYRP1) are the keys to melanin biosynthesis.BLOC-1/2/3 and AP-3 transport TYR and TYRP1 from early endosomes to melanosomes, respectively.If TYR / TYRP1 can not be transported to the melanosomes,the melanin biosynthesis will be suppressed.ATP7A provides copper into tyrosinase,and can activate tyrosinase,however,ATP7A reduction will also reduce melanin synthesis in melanocytes.Following these compounds in the enzyme activity and factors that influence transport tyrosine from different angles to explore the synthesis of melanin,we can understand the synthesis of melanin in different angles.As a base to explore the mechanism of mammalian coat color dilution,we hope to provide a reference for clarifying human melanin synthesis obstacles related diseases.

Melanocyte;melanin;tyrosine enzymes;transport;activity

2016-09-10

吉林省产业创新专项项目(2016c097)；农业部畜禽遗传资源与种质创新重点实验室开放课题项目(nzdsys2016-3)；中国农业科学院科技创新工程项目(ASTIP-ISAPS01)；特种动物种质资源共享平台项目

郭跃跃(1992-)，女，河北人，硕士，主要从事遗传育种相关研究。*通讯作者

S852.33

A

1007-5038(2017)03-0110-05