李稳欣，马利青，薛慧文，王光华

(1.青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁 810016；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070)

文献综述

羊腐蹄病诊断及防治方法研究进展

李稳欣1,2，马利青1*，薛慧文2*，王光华1

(1.青海大学畜牧兽医科学院，青海西宁 810016；2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070)

腐蹄病又称蹄间腐烂或趾间腐烂，是一类引起反刍动物蹄部感染的传染病，以跛行、指(趾)间皮肤肿胀和炎症为主要特征。随着集约化养殖业的快速发展，羊腐蹄病发病率日益增加，给养羊业带来巨大的经济损失，严重制约着养羊业的健康快速发展。但到目前为止，国内学者对羊腐蹄病的诊断与防治方面总结性的报道较少。因此，根据实际情况制定出快速诊断和防治方法显得非常重要。论文以近年来国内外最新的研究资料为基础，从羊腐蹄病病原、临床症状、诊断和防治方法等方面进行综述,以期为羊腐蹄病诊断和防治提供参考。

腐蹄病；临床症状；诊断；防治方法

1960年Adams首次发现腐蹄病，此后该病在美国、比利时、荷兰和澳大利亚等多个国家相继报道[1]。我国牛、羊腐蹄病的发病率也在8%～50%之间[2]。据报道，羊群一旦发生此病，感染率可达80%～90%，还可传染给正在发育的羔羊，严重的将被淘汰，该病已经成为危害反刍动物养殖业发展的重要疾病之一，世界许多畜牧业发达的国家将此病作为重要的传染病进行防控。在中国，夏秋季是该病高发期，尤其是在湿地草场养殖的畜群，牛羊发病率显著高于干燥草场养殖的畜群[3]。羊只感染该病会出现蹄部脓肿，蹄匣变性，随后出现跛行、厌食、长卧不起等症状，处理不当会传染圈舍其他羊只，严重影响养羊业发展。

目前，国内外对腐蹄病的诊断方法除了临床诊断、病原学诊断和血清学诊断外，聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)和荧光原位杂交探针技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)等分子生物学诊断方法也陆续应用到了对该病病原以及细菌型的鉴定。本文就近几年国内外关于羊腐蹄病病原检测技术和防治方法进行综述。

1 病原

1.1 坏死杆菌

大多数研究人员认为腐蹄病主要是由坏死杆菌和节瘤拟杆菌协同感染引起[4]。坏死杆菌包括两个亚种，一种是能够引起动物腐蹄病的Fusobacteriumnecrophorumsubsp.necrophorum亚种(Fnn)，该亚种能产生大量白细胞毒素和溶血素；另一种是接种动物后不能引起动物腐蹄病的Fusobacteriumfunduliformesubsp.funduliforme亚种(Fnf)。坏死杆菌主要基因型有A型、B型和AB型：A型即Fnn亚种，是一种动物源型病原菌，B型即Fnf亚种，是一类人源型病原菌，而AB型的生物学特性介于前两者之间，A型和AB型所分泌的白细胞毒素和溶血素比B型多，这可能是A型比B型毒性更大，对肝脏等组织器官损伤更为严重的主要原因。坏死杆菌的毒力因子有很多，包括对中性粒细胞、巨噬细胞、肝细胞和瘤胃上皮细胞有毒性的白细胞毒素(leukotoxin)、破坏细胞蛋白的血小板凝集素(platelet aggregation factor)、溶解动物红细胞的溶血素(hemolysin)、损坏上皮细胞的皮肤坏死毒素(dermonecrotic toxin)、胞外酶(extracellular enzymes)、黏附素(adhesins)和具有裂解牛Ⅱ型胶原蛋白能力的溶胶原活性蛋白(collagenolytic protein)等。其中白细胞毒素是引起腐蹄病的主要毒力因子[5-6]，操纵子包括3个基因，分别是lktA、lktB和lktC，其中结构性基因为lktA基因，是一段由3 241个核苷酸组成的蛋白质，该细菌的外毒素分子质量比任何已知的溶血性巴氏杆菌、放线菌和金黄色葡萄球菌的细菌外毒素分子质量都大。因此，坏死杆菌中A型所分泌的白细胞毒素(lktA)是腐蹄病坏死杆菌检测和疫苗研究的重要靶蛋白。

1.2 节瘤拟杆菌

节瘤拟杆菌(Dichelobacternodosus)归属拟杆菌科(Bacteroidaceae)拟杆菌属(Bacteroides)。该菌存在多个血清型，全世界范围内分布不一，一个动物群体可能存在该菌多个血清群。节瘤拟杆菌的致病因子是其表面的细胞外蛋白酶和极性纤毛，其毒力强弱与其分泌的蛋白溶解酶有一定关系，拥有强毒性的菌株所分泌的蛋白溶解酶可以损伤所侵入部位的蛋白组织[7]。节瘤拟杆菌主要侵害受感染动物蹄部，能分泌一种弹性蛋白，菌株的毒力越强，弹性蛋白分泌能力就越强，该蛋白软化蹄角质，造成蹄部浅表炎症，使蹄部的皮肤表层及其基层完整性受损，为坏死杆菌的入侵和感染提供便利条件。由于纤毛蛋白是该菌体的主要保护性抗原，是血清型分群依据，因而针对纤毛蛋白开展的研究工作较多。到目前为止，GenBank检索D.nodosus纤毛蛋白基因序列共有77条。按血清群A、B、C、D、E、F、G、H、I和M归类来自不同菌株的纤毛蛋白基因序列，这些序列在测序和注释后，录入核酸数据库，丰富了纤毛序列的核酸序列数据，为通过序列比较分析，准确设计保守性引物，开展D.nodosus分子生物学检测提供了条件。Bennett G等[8]研究报告显示，在羊的腐蹄病病例中，节瘤拟杆菌约占60%，坏死杆菌约占30%。然而有其他学者认为，在羊的腐蹄病病例中，坏死杆菌的感染占40%左右，而节瘤拟杆菌的感染占30.7%左右。以上数据虽有所不同，但二者表明坏死杆菌和节瘤拟杆菌是感染羊腐蹄病的主要病原菌。

1.3 其他相关病原

很多研究者认为，腐蹄病是由多种微生物引起的疾病，在羊的腐蹄病病例中可分离到普雷沃菌(Prevotella)和卟啉单胞菌(Porphyromonas)；与腐蹄病相关的细菌还有微球菌(Micrococcus)、粪弯杆菌(Campylobacter)、变形杆菌(Proteusbacillusvulgaris)、葡萄球菌(Staphylococcus)、大肠埃希菌(Escherichiacoli)、链球菌(Streptococcus)、沙门菌(Salmonella)和化脓棒状杆菌(Corynebacteriumpyogenes)等病原微生物[9-10]。由于羊蹄部长期暴露于外界环境中，环境中病原菌又复杂多样，尤其在夏季患羊被蚊蝇叮咬，细菌和蝇蛆孳生常使患部不断扩大恶化，致使病情加重。草料中的钙、磷不平衡，维生素缺乏，导致角质疏松，蹄部变形，以及因饲养管理员对羊蹄部长期不修正，都会给腐蹄病的病原菌侵入提供机会。

2 临床诊断

2.1 临床症状

本病潜伏期1 d～3 d，从感染到发病的几小时后，患病动物可出现单肢跛行，多数发生在后肢趾间隙和蹄冠部，按压时患畜出现严重的疼痛反应并伴有发热、肿胀等症状，喜卧不愿站立，局部检查可见病畜蹄关节弯曲，蹄趾皮肤充血、肿胀，严重的可以引起球关节炎、蹄关节炎和蹄匣脱落等，一般患畜的体温会轻微升高，有时可高达到40℃～41℃；患羊精神沉郁、食欲废绝、体重下降、生产能力丧失和蹄壳脱落；如果不及时治疗，病畜出现严重的全身症状后，有可能导致患病动物的死亡。

2.2 病理变化

被感染的病畜趾间隙皮肤表层湿润，并附有一层气味难闻的灰白色黏液，患畜感染3 d～4 d后，蹄部的被毛开始脱落，8 d～9 d后，病变逐步蔓延，可至蹄匣内壁底层的蹄角处，形成囊肿，致使患蹄的蹄角层与真皮层分离；严重时，炎症可蔓延到患蹄的内外两侧壁，蹄角层的角质变得很薄极易从真皮层脱落。不过，此时的损伤只是局限在蹄部软组织和真皮层；局部组织也会出现坏死，有的会形成肉芽组织，表面会机化或钙化。大多数病死于蹄趾间患有腐烂病的动物，除了体表有病变外，有的也会在内脏器官上出现蔓延性或转移性坏死灶，一般在肺脏器官内出现大小不一，数量不等，圆形质地坚硬，切面干燥，灰黄色结节。基于上述症状可以做出初步诊断。

3 实验室诊断

3.1 病原分离鉴定

坏死杆菌和节瘤拟杆菌的培养条件苛刻，分离纯化的难度大，必须进行严格的厌氧培养。目前，常用于分离两种菌的培养基有哥伦比亚血平板、MEB固体培养基、卵黄培养基等；用于增菌的培养基有改良的MEB液体培养基、脑心浸液肉汤培养基、硫乙醇酸盐流体培养基等。分离、纯化好的坏死杆菌经革兰染色，光学显微镜下呈现红色，长丝状，宽0.5 μm～1.75 μm，长100 μm～300 μm，经增菌培养传代后，菌体长度缩短，直到为长杆状后，基本不变。固体培养基生长菌，短杆状或球状菌菌体最常见。节瘤拟杆菌为革兰阴性杆菌，光学显微镜下可见细菌一端、两端或多处膨大，菌体平直或稍弯曲，大小是1 μm～1.7 μm×3 μm～6 μm。

3.2 血清学诊断

具有快速、敏感和高通量检测等优点的血清学诊断技术逐渐在腐蹄病病原诊断上得到广泛应用。郭东华等[11]通过免疫试验证实，坏死杆菌白细胞介素重组蛋白PL2可以介导小鼠产生很高水平的抗体。Guo D H等[12]也利用坏死杆菌中白细胞介素PL2重组蛋白作为抗原，建立了检测奶牛腐蹄病坏死杆菌抗体的间接ELISA，并通过试验证实，该方法具有较高特异性和敏感性，在腐蹄病坏死杆菌早期诊断中发挥潜在应用价值。Dhungyel O P等[13]曾用节瘤拟杆菌菌毛抗原作为ELISA诊断抗原进行了绵羊毒性腐蹄病的血清型诊断。

3.3 分子生物学诊断

为了满足试验的需求，基因探针和PCR等分子生物学诊断技术迅速发展并在动物病原诊断中广泛运用，为腐蹄病病原早期诊断提供依据。

3.3.1 聚合酶链反应(PCR) 为了更准确的区分坏死杆菌和节瘤拟杆菌的血清型，国内外学者开始根据两者特异性的基因设计引物，建立准确、快速的PCR检测方法。其中，卲西群[14]根据不同基因型的特异性片段设计相应引物，筛选出节瘤拟杆菌基因型，建立了节瘤拟杆菌早期PCR诊断方法。姚志利等[15]根据坏死梭杆菌毒力因子白细胞毒素启动子区的特异性序列设计了3条引物，建立了双重PCR检测方法对坏死梭杆菌进行分型检测。Witcomb L A等[16]以坏死杆菌rpoB的和节瘤拟杆菌的rpoD基因设计引物并使用TaqMan○R探针建立了实时荧光定量PCR的检测方法。目前，Kumar A等[6]、Farooq S等[4]、Sullivan L E等[17]和孙东波等[18]以坏死杆菌的16 S rRNA、白细胞毒素、溶血素等主要基因设计引物，在分子生物学水平上对坏死杆菌做出了检测。李林等[19]、Farooq S等[4]、Vinod K N[20-21]、Frosth S[15]和locher I[22]等针对节瘤拟杆菌的纤毛蛋白、16 S rRNA、intA蛋白基因和AprV2/B2基因设计特异性引物对节瘤拟杆菌进行分子生物学检测。

3.3.2 环介导等温扩增技术(LAMP) PCR虽然操作简单，扩增产物也在很短时间内聚集，但需价值昂贵的试剂及PCR仪，并不适合基层临床检测。而LAMP能识别靶序列6个位点的4条特异性引物和具有链置换功能的BstDNA聚合酶，恒温条件下可以快速扩增靶基因。试验结果可通过肉眼观察，也可通过琼脂糖凝胶电泳来观察目的条带。该技术具有特异性强、灵敏度高、等温高效、操作简单等特点。Sun D B等[23-24]根据坏死杆菌白细胞介素基因设计引物建立了检测奶牛腐蹄病坏死杆菌的Fn-LAMP检测方法，以节瘤拟杆菌16 S rRNA作为扩增靶基因设计引物建立了检测节瘤拟杆菌的Dn-LAMP检测方法。因扩增产物具有可视化特点，所以，在临床病原的检测中得到广泛应用。

3.3.3 斑点杂交和荧光原位杂交检测方法 核酸探针技术是一种快速、灵敏和特异的检测方法，能特异性地与待测样品中特定DNA或RNA发生杂交反应，然后通过显色确定检测结果。姚志利根据坏死杆菌rpoB基因设计了一对589 bp的特异性引物，在分子水平上建立了检测致病性坏死杆菌的斑点杂交检测方法，该方法具有较高特异性，能鉴定坏死杆菌种属。试验通过对28份临床样本的检测，其检出率为60.7%，如果每个斑点点5 μL DNA样品时，其最低检测浓度为1×10-2pg/μL。Witcomb L A等[25-26]先后采用荧光原位杂交探针技术检测节瘤拟杆菌和坏死杆菌，并通过荧光标记探针准确检测血液和组织中微量的坏死杆菌和节瘤拟杆菌，从而解决了分离培养时细菌生长缓慢的难题。

3.4 鉴别诊断

羊腐蹄病要与临床上症状较相似的口蹄疫、蹄脓肿、蹄叶炎、蹄白线裂以及其他非特异性的化脓菌感染的疾病加以鉴别诊断。口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的猪、牛、羊等偶蹄动物感染的一类在口腔黏膜以及乳房等部位发生炎症和不同程度水疱或烂斑的传染病，一般发病呈“大流行性”，潜伏期1 d～7 d。而羊腐蹄病主要感染羊蹄部角质层和蹄部软组织，并不引起口腔病变。蹄脓肿是由坏死杆菌和化脓棒状杆菌引起猪、牛、羊等易感动物蹄部肿烂，发生进行性坏死，引起蹄匣脱落的一类疾病。且蹄脓肿仅感染趾，常呈散发，一年四季均可发生。而羊腐蹄病多发于地面潮湿、多雨的夏秋季节。蹄叶炎是由变态反应引起，也可由蹄部血液循环障碍或外伤引起，常感染马、牛、羊等动物，其蹄壁前半部的真皮小叶层及血管层呈弥漫性、无菌性炎症，指动脉亢进，蹄壁增温，叩压蹄尖壁有疼痛反应。

4 防治方法

4.1 常规防治

患病初期，对患病羊只隔离，清扫圈舍，保持圈舍干燥。先用清水洗净患羊蹄部渗出的污物，揭掉表层坏死腐烂的角质层，然后用20 g/L～3 g/L甲酚皂溶液清洗消毒患部，涂上磺胺软膏，再用纱布包扎，取得了较好的治疗效果。针对急性严重性病例，用庆大霉素、头孢唑林、红霉素和磺胺类等抗菌药物进行全身防治以防败血症发生，同时联合服用锌制剂。有报道证实，羊腐蹄病发生与锌和钙缺乏有关。日粮中添加氨基酸鳌合锌的饲料添加剂来饲喂家畜会大大降低蹄部疾病发生。目前，最常用的方法是用100 g/L硫酸铜、100 g/L硫酸锌和1 g/L高锰酸钾等进行蹄部药浴。也有人采用涌泉穴封闭疗法和中药疗法来预防和治疗腐蹄病的发生，并取得了一定的疗效[27]。

4.2 免疫预防

羊腐蹄病灭活苗、重组亚单位疫苗和基因工程苗已取得了显著成效。Narayanan S K等[28]利用坏死杆菌白细胞介素基因研制出了羊腐蹄病疫苗，该疫苗对小鼠有很好的免疫保护作用。郭东华等[11，29]用大肠埃希菌表达系统表达并纯化了坏死杆菌白细胞介素的5种蛋白，并通过免疫小鼠试验证实，这5种重组蛋白和天然的白细胞介素都可介导小鼠产生抗白细胞介素的特异性抗体，并且抗体效价可达1∶12 800。吕思文[30]以腐蹄病坏死梭杆菌主要的毒力因子溶血素(hly)、lktA和43K外膜蛋白为研究对象，筛选出三者的抗原表位区，为后期制备多个抗原表位区相互结合的保护性抗原提供了理论基础。吴洪超等[31-32]将坏死杆菌白细胞介素中的具有抗原性的两个基因BSBSE、SH构建成Pet32a-BSBSE-SH表达载体，并成功在大肠埃希菌中融合表达，纯化后加入佐剂制成坏死杆菌白细胞介素重组亚单位疫苗，同时又根据坏死杆菌血凝素相关外膜蛋白基因上的抗原表位设计引物，用扩增出的片段构建重组表达质粒pET-28a-p1、pET-32a-p2和pET-32a-p3，并在大肠埃希菌中诱导表达，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western blot,WB)分析蛋白的表达情况和反应原性；以纯化的重组蛋白为抗原免疫注射试验兔，可以刺激兔产生特异性抗体，说明坏死杆菌血凝素相关外膜蛋白具有很好的免疫原性，为今后融合重组亚单位疫苗的研制提供基础性依据。廖党金等[33]采用奶牛坏死杆菌制剂预防绵羊腐蹄病取得显著的效果。国内研制出的E型节瘤拟杆菌的纤毛蛋白基因和IL-2(白细胞介素2)融合基因的工程苗和C型节瘤拟杆菌基因工程苗，在羊群上有较好的免疫保护性。Gurng R B等[34]根据节瘤拟杆菌筛选出来的毒力菌株制备节瘤拟杆菌二价苗来免疫羊只，并通过对照试验证实该疫苗具有很高的免疫原性。Bennett G N等[35]也首次将反向疫苗学技术应用到腐蹄病免疫预防上。就目前而言，重组亚单位疫苗、基因工程苗和反向疫苗学的研制技术还不够成熟。因此，制备高效、安全的疫苗有待进一步研究。

5 结语

综上所述，国内外学者在腐蹄病的病原学、临床诊断、实验室诊断以及防治方面已经开展了深入的研究。目前PCR、实时荧光定量PCR、LAMP及核酸探针等检测方法已经开始应用于该病的精确诊断。在防治方法方面除加强日常饲养管理、提供全价日粮、定期修剪蹄部、搞好环境卫生外，应用现代分子生物学技术，研制高效安全疫苗和新兽药是发展趋势，相信通过疫苗预防、营养调节、卫生环境的改善、精确诊断以及合理用药等综合防治措施的实施，可有效减少该病的发病率，从而保障养殖业的健康发展。

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Progress on Diagnosis,Prevention and Treatment Methods of Footrot in Sheep

LI Wen-xin1,2,，MA Li-qing1，XUE Hui-wen2，WANG Guang-hua1

(1.QinghaiAcademyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,QinghaiUniversity,Xining,Qinghai,810016,China；2.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgricultureUniversity,Lanzhou,Gansu,730070,China)

Footrot,also called as decay between toes or hoofs is a infectious disease of ruminants characterized by lameness,swelling and inflammation of foot skin.With the rapid development of intensive livestock farming,the morbidity of sheep due to footrot is becoming increasingly serious.It can cause immeasurable economic loss and imposes serious restrictions on the sheep industry and development.Therefore,it is very important to develop quick diagnostic and prevention methods for this disease.However,there are few conclusive reports on this field in China.Based on the latest international and domestic research works,the pathogens,clinical symptoms,diagnosis,prophylaxis and treatment methods of sheep footrot were summarized.

footrot;clinical symptom;diagnosis;prevention and treatment method

2016-08-16

国家农业产业技术体系项目(CARS-40-4B)

李稳欣(1989-)，女，河南开封人，硕士研究生，主要从事动物疫病相关研究。*通讯作者

S857.119;S857.165

A

1007-5038(2017)03-0097-05