吕耀龙,李少英,赵春杰,包丹丹

(1.内蒙古农业大学职业技术学院,内蒙古包头 014109:2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

内蒙古达茂旗牧区牛乳中乳酸菌的耐药性及gyrA基因分析

吕耀龙1,李少英2,*,赵春杰1,包丹丹1

(1.内蒙古农业大学职业技术学院,内蒙古包头 014109:2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

本研究以内蒙古达茂旗牧区牛乳中分离的16株乳酸菌为研究对象,采用纸片扩散法对氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星和链霉素四种抗菌药进行耐药性测定。实验结果表明:93.75%的菌株对氧氟沙星和链霉素表现为耐药,100%的菌株对环丙沙星和诺氟沙星表现为耐药;耐药菌株经PCR扩增、gyrA基因编码的氨基酸序列分析,发现有1株乳酸菌的耐药性与gyrA基因突变有关。

乳酸菌,耐药性检测,gyrA基因分析

内蒙古达茂旗牧区牛乳中富含乳酸菌资源,这些菌种在食品业、饲料业和医药业等相关领域广泛应用[1]。乳酸菌有着较长的安全使用历史,近年来研究表明,抗生素在医药、饲料等行业使用泛滥,导致微生物耐药问题日趋严重,致使人们在应对微生物性疾病时面临严峻挑战[2]。有研究表明,临床分离的细菌中有近50%～70%的乳酸菌对氟喹诺酮类药物表现出耐药性[3-4]。

乳酸菌对喹诺酮类的氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星和氨基糖苷类的链霉素四种抗菌药物表现为较高的耐药率,但也存在一定的差异性[3-8]。四种抗菌药物在不明确菌株耐药机理的情况下盲目研究其耐药性防控乃至用于生产实践,将造成后续工作的不确定性。乳酸菌耐药机理之一是拓扑异构酶基因突变介导,Ⅱ型拓扑异构酶(主要是DNA旋转酶)是喹诺酮类等药物的作用靶位,DNA旋转酶组成之一是gyrA基因编码A亚基[5]。本文旨在研究内蒙古达茂旗牧区牛乳中乳酸菌对氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星和链霉素四种抗菌药物的耐药性和耐药机理gyrA基因分析,为乳酸菌选育提供了方向、耐药机理研究提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验菌株 来自内蒙古达茂旗牧区牛乳中分离纯化保存的菌种,共16株,分别为:DM1、DM2、DM3、DM4、DM6、DM8、DM9、DM10、DM11、DM13、DM14、DM15、DM17、DM18、DM19、DM21;标准菌株 粪肠球菌Enterococcusfaecalis(CICC:23658)标号FC,购于中国工业微生物菌种保藏中心;质控菌株:大肠杆菌Escherichiacoli(ATCC:25922)标号DC,购于中国工业微生物菌种保藏中心;琼脂糖 Sigma公司、细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司;2×Easy Tap PCR Supermix 北京全式金生物技术有限公司;DL2000 DNA Marker 北京全式金生物技术有限公司;6×Loading buffer 北京全式金生物技术有限公司;核酸染料 北京赛百盛生物工程公司;gyrA基因扩增引物:上游:5′-gagggatagcggttagatgag-3′,下游:5′-ccgttcaccagcaggttagg-3,中美泰和生物技术(北京)有限公司,查阅文献[5]而定。

链霉素(C014,10 μg/片)、环丙沙星(C045,5 μg/片)、诺氟沙星(C033,10 μg/片)、氧氟沙星(C044,5 μg/片) 杭州天和微生物试剂有限公司。TPY培养基、MRS培养基和脱脂乳培养基,按文献[9]进行配制。

表1 纸片法使用的抗菌药物及药物敏感型标准(CLSI)Table 1 The standard of antibacterial drug and drug sensitivity of paper method(CLSI)

注:S(susceptible)为敏感;R(resistant)为耐药;I(intermediate)为中度敏感。

荧光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;超净台 哈尔滨市东联公司;离心机 Eppendorf公司;电泳仪 北京市六一仪器厂;PCR扩增仪 BIO-RAD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化 按照文献[10]中方法进行。

1.2.2 供试菌液制备 按照文献[3]中方法进行。

1.2.3 采用纸片扩散法测定实验菌株的抑菌直径 用无菌的吸管吸取1 mL供试菌液,分别加入未凝固的25 mL MRS培养液中,充分摇匀后倒入平皿中待凝固。在凝固好的平皿中均等的放置2个药敏纸片、1个空白纸片。同样方法做质控菌株对照。37 ℃恒温培养24 h后,测量抑菌圈直径。上述实验每个菌株都做3次重复。

1.2.4 实验菌株对四种抗菌药物的敏感性判断标准 供试菌株对四种抗菌药物的药敏性参照美国临床和实验标准协会(CLSI)[10-11]规定的标准(见表1)进行,报告该供试菌对四种抗菌药物是敏感,用S表示,中度敏感I表示,耐药R表示[11-12]。

1.2.5 实验菌株DNA提取 按照细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)操作步骤提取。

1.2.6 实验菌株DNA验证 取5 μL提取后的实验菌株DNA与0.5 μL的6×Loading buffer混匀,点入1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,观察条带。电泳参数:电泳液为1×TBE buffer,电压为110 V,时间为30 min。

1.2.7 PCR扩增 实验菌株的gyrA基因引物的设定是参照文献[5]中公布的引物进行,扩增片段为500 bp,由中美泰和生物技术(北京)有限公司提供合成。

PCR扩增体系为50 μL:模板DNA(4 μL)、上游引物(1 μL)、下游引物(1 μL)、2×Easy Tap PCR Supermix(25 μL)、ddH2O(19 μL)。

PCR循环参数[5],预变性:94 ℃、3 min,(变性:94 ℃、30 s,退火:60 ℃、30 s,延伸:72 ℃、1 min)45个循环,末端延伸:72 ℃、5 min。

1.2.8 扩增产物验证 将提取的DNA取5 μL点入1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,观察条带。电泳参数:电泳液为1×TBE buffer,电压为110 V,时间为30 min。

1.2.9 扩增产物测序 将1.2.7中gyrA基因引物的PCR扩增产物送中美泰和生物技术(北京)有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 供试菌株耐药抑菌圈直径及药敏结果

供试菌株培养24 h后,测量培养皿抑菌圈直径大小求平均值,药敏结果见表2,耐药率结果见表3。

表2 四种抗菌药物对16株乳酸菌的抑菌直径及药敏结果Table 2 Antibacterial diameter and the susceptibility results of four kinds of antibacterial drugs treatments against 16 strains of lactic acid bacteria

注:W为在CLSI规定值范围之内。

表3 16株实验菌株对四种抗菌药物的耐药率Table 3 Drug-resistance rates of the 16 Strains of lactic acid bacteria tested against the four kinds of Antimicrobials

表4 四种抗菌药物对实验菌株抑菌直径的F检验Table 4 F test of four Kinds of Antimicrobials against the antibacterial diameter of 16 strains of lactic acid bacteria tested

从表2、表3结果表明,16株菌对氧氟沙星只有DM17表现为中度敏感,其余均为耐药;对环丙沙星和诺氟沙星均表现为耐药;对链霉素DM11表现为中度敏感,其余均为耐药。16株实验菌株对氟喹诺酮类和氨基糖苷类两大类四种药的耐药率较高,氧氟沙星和链霉素为93.75%,环丙沙星和诺氟沙星为100%。

质控菌株大肠杆菌对氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星和链霉素的耐药直径均在CLSI规定允许的范围内,说明实验菌株耐药直径数值可靠准确。

2.2 实验菌株的耐药性分析

结合上述实验结果做四种抗菌药物对实验菌株抑制性差异的分析,结果如表4。

从表4可以看出,四种抗菌药物对乳酸菌的抑制作用差异极显著,显著水平p<0.01。

2.3 实验菌株DNA提取条带和PCR扩增条带

DNA提取条带如图1所示。目的条带与预期条带大小一致。个别样品出现拖尾现象是因酶量过多或退火温度低产生了PCR特异性产物。

图1 实验菌株总DNA的琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total DNA of lactic acid bacteria tested

实验菌株gyrA基因的PCR扩增条带如图2、图3所示。

图2 实验菌株gyrA基因引物1PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of gyrA gene primer of lactic acid bacteria tested

图3 标准菌株和质控菌株gyrA基因引物PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of gyrA gene primer of standardized and quality-controlled strains

分析部分实验菌株未出现条带,主要是因引物存在特异性所致。

2.4 实验菌株gyrA基因编码的氨基酸序列分析

将gyrA引物扩增DM21、FC和DC的测序结果输入软件DNASTAR中的EditSeq中翻译成氨基酸序列,后将DM21和FC、DM21和DC分别输入MegAlign进行氨基酸序列比对,结果详见图4、图5。

由图4的结果表明,实验菌株DM21相对标准菌株FC的gyrA基因的碱基突变导致gyrA亚基发生氨基酸序列的改变,共有2个氨基酸发生了改变,改变位点是142位L(Leu)变为W(Trp)、145位R(Arg)变为T(Thr)。图5的结果表明,实验菌株DM21相对质控菌株DC的gyrA基因的碱基突变导致gyrA亚基发生氨基酸序列的改变,共有3个氨基酸发生改变,改变位点是142位G(Gly)变为W(Trp)、143位D(Asp)突变为G(Gly)、145位R(Arg)变为T(Thr)。

图4 菌株DM21和FC的gyrA基因氨基酸序列的比对结果Fig.4 Comparision results of amino acid sequence of gyrA gene of DM21 and FC

图5 菌株DM21和DC的gyrA基因氨基酸序列的比对结果Fig.5 The comparision results of gyrA gene amino acid through DM21 and DC sequence

马沁沁[13]等研究发现分离自四川地区人肠道及发酵食品的52株乳杆菌中,60%以上的菌株分别对红霉素、万古霉素、诺氟沙星和环丙沙星耐药;董春阳[14]对48株乳酸菌耐药性研究发现,95.83%的菌株对链霉素表现为耐药,45.83%的菌株对环丙沙星表现为耐药;秦宇轩[15]等市售酸奶中分离到100株乳酸菌,均对链霉素和庆大霉素耐药;杜金城[16]等对具有抑制大肠杆菌作用的3株乳酸菌进行耐药实验发现,对氨基糖苷类的抗生素展现出耐受,吕耀龙[17]研究内蒙古达茂旗牧区牛乳中乳酸菌对氧氟沙星的表现为较高的耐药率。本实验研究结果与以上学者实验结果一致,16株乳酸菌对氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星和链霉素表现为较高的耐药率,分别为93.75%、100%、100%、93.75%。于涛[18]在56株乳酸菌中共检出5种不同的耐药基因;霍小琰[5]通过对耐药菌株DNA拓扑异构酶ⅡgyrA基因进行PCR扩增、测序,与敏感性大肠杆菌gyrA基因进行突变位点的比较,发现10株耐氟喹诺酮类抗菌药乳酸菌的gyrA基因位点发生突变,证实实验菌株对喹诺酮类抗菌药产生的耐药性与菌体DNA拓扑异构酶Ⅱ gyrA基因突变有直接关系。宋晓敏[19]研究乳酸菌耐药机理发现,耐药菌株的gyrA和parC基因发生氨基酸突变,证实这些氨基酸突变与菌株耐氟喹诺酮类药物有关;gyrB基因中引入了终止密码子,出现无义突变,可能是菌株耐药的原因之一。目前人类滥用抗菌药物严重,乳酸菌对多数抗菌药物表现为不同程度的耐药,分析本实验研究结果,发现部分菌株的gyrA基因的碱基突变导致gyrA亚基发生氨基酸序列的改变是致使乳酸菌耐药的原因所在。

3 结论

16株乳酸菌中,对4种抗菌药物表现为较高的耐药率,93.75%的菌株对氧氟沙星、链霉素表现为耐药,100%的菌株对环丙沙星、诺氟沙星表现为耐药。

内蒙古达茂旗牧区牛乳中乳酸菌对部分抗菌药物呈现较高的耐药性,经gyrA基因PCR扩增、氨基酸序列分析,菌株DM21的耐药性与gyrA基因突变有直接关系。鉴于此,对食品工业而言,在选育高发酵力乳酸菌的同时还应考虑发酵产物的品质和安全性;对乳酸菌耐药性研究而言,致使耐药因素较多,应对拓扑异构酶基因突变、主动外排系统和质粒介导等逐一研究排查。

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Study on drug resistance testing and gyrA gene analysis of milk lactobacillus of Damao pastoral areas of Inner Mongolia

LV Yao-long1,LI Shao-ying2,*,ZHAO Chun-jie1,BAO Dan-dan1

(1.Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricultural University,Baotou 014109,China;2.Food Science and Engineering College of Inner Mongolia Agricultural University,Hohhot 010018,China)

The research subject of this study was sixteen strains of lactobacillus which separated from milk of Damao pastoral areas of Inner Mongolia,and paper diffusion method was used to test the drug resistance of four kinds of antibacterial drugs of ofloxacin,ciprofloxacin,norfloxacin,and streptomycin. The results showed that 93.75% of sixteen strains of lactobacillus were resistant to ofloxacin and streptomycin,and 100% of sixteen strains of lactobacillus were resistant to ciprofloxacin and norfloxacin. The results of PCR amplification and amino acid sequence analysis for all drug resistance lactobacillus showed that the resistance of one strains of lactobacillus was related to mutation of gyrA gene.

Lactobacillus;drug resistance testing;gene analysis of gyrA

2016-08-19

吕耀龙(1982-)，男，硕士研究生，讲师，主要从事食品微生物研究，E-mail:lylong1982@163.com。

*通讯作者:李少英(1961-)，女，博士研究生，教授，主要从事有益微生物的研究，E-mail:nmglshy@126.com。

内蒙古高等学校科学研究项目(NJ09059)；国家自然科学基金项目(31060014)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)03-0166-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.03.023