尹业兴，李青云，2，刘幽燕，2

（1. 广西大学 化学化工学院，广西 南宁 530004；2. 广西生物炼制重点实验室，广西 南宁 530003）

产碱杆菌DN25去除金矿废水中的氰

尹业兴1，李青云1，2，刘幽燕1，2

（1. 广西大学 化学化工学院，广西 南宁 530004；2. 广西生物炼制重点实验室，广西 南宁 530003）

采用产碱杆菌（Alcaligenes sp.）DN25去除金矿选矿废水和矿渣浸出液中的氰。考察了菌株DN25的除氰效果，研究了DN25生长和降解活性的影响因素。实验结果表明：利用DN25处理选矿废水，当反应时间为23 h时，总氰质量浓度分别从162.6，32.4，21.0，22.3 mg/L降至0，0.07，0，1.24 mg/L；利用DN25处理矿渣浸出液，当反应时间为25 h时，总氰质量浓度分别从 4.4，8.8 mg/L降至0.37，0.38 mg/L；处理后两种废水的总氰质量浓度均满足GB 8978—1996《污水综合排放标准》的要求；DN25可在初始总氰质量浓度为10～30 mg/L且仅含碳源的条件下生长但存在24 h停滞期，而在初始总氰质量浓度为5～20 mg/L且含碳、氮源的条件下没有生长停滞期。

生物处理；金矿废水；氰化物；产碱杆菌

氰化物常用于金矿提金，产生的废水中除了含有游离氰和络合氰［1］，还常有砷、铅、镉等有毒物质［2］。据统计，我国仅黄金生产企业所排放含氰废水就达1. 2×108m3/a［3］。当前金矿废水中氰的去除方法主要有自然分解、化学处理、生物分解、电解氧化等方法［4-5］。相比于其他方法，生物分解法具有成本低、分解快且无二次污染物等诸多优点［6］。2000年美国环境保护署（EPA）对生物法处理氰污染技术的评估［7］中指出，生物法是一种有前景的治理方法。尽管氰化物对大部分微生物具有毒性，但在自然界中仍存在可高效分解氰的微生物。目前，已报道的氰分解菌包括产碱菌（Alcaligenes. sp）、芽孢杆菌（Bacillus. sp）、假单胞菌（Pseudomonas. sp）和克雷伯氏杆菌（Klebsiella. sp）等［8］，这些微生物的存在为氰污染修复奠定了基础。近十年来，我国有关氰化物生物处理的研究大部分还处于实验室水平，对实际工业废水处理的报道较少。郭训文等［9］利用曝气生物滤池（BAF）处理含氰电镀废水，当CN-初始质量浓度低于35.34 mg/L时，出水CN-质量浓度低于0.20 mg/L。上世纪80年代初，美国Homestake公司在南达科他州的铅矿区运用48片生物转盘（RBC）连续处理氰化物，总氰化物的去除率可达91.0%～99.5%［4］。

本工作对本实验室前期从氰污染土壤中分离得到的一株高效分解氰的菌株DN25［10］，进一步探讨该菌株对实际含氰废水的处理效果，考察了该菌株对废水中游离氰和总氰的分解情况，初步分析了实际含氰废水对菌株生长、分解活性的影响，以期为生物法处理氰污染物的工程应用提供技术准备。

1 实验部分

1.1 材料、试剂和仪器

选矿废水： 采自广西某金矿厂不同工段，共4个水样（1#～4#）；矿渣浸出液：为云南某金矿厂矿渣经去离子水4 ℃静置浸取12 h后的浸出液（5#）。各水样的废水水质见表1。

表1 废水水质 mg/L

菌株：产碱杆菌（Alcaligenes sp.）DN25，由本实验室自行筛选获得。

LB培养基： NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，蒸馏水1 000 mL， pH 8.0。固体平板培养基添加1.5%（w）琼脂。该培养基用于菌体培养。

M9培养基：Na2HPO4·12H2O 17.1 g，KH2PO43 g，NaCl 0.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 8.0。根据实验目的，在M9培养基中分别外加碳源葡萄糖1.5 g及氮源氯化铵 0.27 g。将该培养基加入矿渣浸出液中，分别考察外加碳源、碳氮源条件下的菌株生长情况。

实验所用试剂均为分析纯。

723型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；Optima 5300DV 型电感耦合等离子体发射光谱仪：美国铂金埃尔默仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DN25菌体的培养

用接种环从平板培养基上挑取一环产碱杆菌DN25接种至100 mL灭菌的LB培养基中， 30 ℃、120 r/min恒温摇床振荡培养35 h，然后8 000 r/min离心20 min，收集菌体。再用pH 8.0、50 mmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2次，取适量缓冲液重悬菌体，配制得到600 nm处光密度（OD600）为10.0的菌液，待用于氰分解实验。

1.2.2 菌株DN25对水样中氰的分解

在250 mL摇瓶中分别加入100 mL水样，调节pH为8.0，然后投加5 mL菌液，使反应初始OD600为0.5，同时取样测定初始游离氰及总氰质量浓度。将瓶口密封，在30 ℃、120 r/min条件下进行分解反应，于设定的时间取样测定残余游离氰及总氰质量浓度。

1.2.3 菌株DN25生长及活性的影响因素

按照文献［10］方法制备种子液。在50 mL总氰质量浓度分别稀释为5，10，15，20，30 mg/L（游离氰质量浓度分别为 3.5， 5.6， 8.9， 9.6， 12.3 mg/ L）的矿渣浸出液稀释液中，按照1%的接种量接种（OD600=0.1）后，在与1.2.1节相同的培养条件下培养菌体，定时取样，测定菌液的OD600值，同时监测体系中游离氰的浓度变化。

将含有碳源或碳氮源的M9培养基加入到矿渣浸出液稀释液中，按同样方法考察菌株DN25的生长及活性变化。

1.3 分析方法

菌液浓度以OD600表征，采用723型可见分光光度计测定菌液在波长600 nm处的光密度值。游离氰和总氰质量浓度的测定参照国家标准方法［11］。水质分析采用电感耦合等离子体发射光谱仪测定［12］。COD的测定采用快速消解分光光度法［13］。

2 结果与讨论

2.1 菌株DN25对选矿废水的除氰效果

菌株DN25对选矿废水中游离氰的去除效果见图1。由图1可见：氰的分解过程主要发生在前30 min，其中1#水样中氰的分解速率最快，30 min时游离氰去除率为90.2%，而2#、3#、4#的去除率分别为64.9%，43.5%，10.0%；反应至330 min时，游离氰质量浓度分别为 3.0，5.8，4.2，10.0 mg/L，去除率分别为96.7%，74.5%，68.4%，31.8%。

图1 菌株DN25对选矿废水中游离氰的去除效果初始游离氰质量浓度/（mg·L-1）：● 1#；■ 2#；▲ 3#；◆ 4#游离氰去除率/%：○ 1#；□ 2#；△ 3#；◇ 4#

当反应时间为23 h时，菌株DN25对选矿废水中总氰的去除效果见表2。由表2可见，1#，2#，3#水样的总氰去除率达99.7%以上，其中1#、3#水样中的总氰能被菌株DN25完全去除，而4#水样的总氰去除率为94.4%，剩余总氰质量浓度为1.24 mg/ L，说明菌株DN25既能分解游离氰也能分解部分络合氰化物，但对于Fe（CN）64-、Fe（CN）63-等可生物分解性差的络合氰［14］的分解仍比较困难。处理后选矿废水的总氰质量浓度分别为 0，0.1，0，1.2 mg/L，满足GB 8978—1996《污水综合排放标准》的要求［15］。实验结果初步显示，产碱杆菌DN25对实际含氰废水的处理具有一定应用潜力。

表2 菌株DN25对选矿废水中总氰的去除效果

2.2 菌株DN25对矿渣浸出液的除氰效果

菌株DN25对矿渣浸出液中游离氰及总氰的去除效果分别见图2及图3。由图2可见，相比于选矿废水，菌株DN25对矿渣浸出液中游离氰的分解较为缓慢，30 min时的游离氰去除率仅为32.7%，反应至480 min时，游离氰去除率也仅为47.4%，这可能是由于矿渣浸出液中重金属离子如As2+、Zn2+等对菌株活性存在更强的抑制作用。Jandhyala等［16］研究发现，当溶液中单独存在200 μmol/L的 Pb2+或Zn2+时便会抑制菌株中氰分解酶的活力，使其降低25%以上。菌株对总氰的分解也具有相类似的情况。由图3可见，反应15 h后的总氰去除率为40.0%，反应44 h后的总氰去除率为42.3%。为了提高总氰的去除率，反应44 h时追加等量菌体，反应至88 h时，总氰去除率为51.2%，处理效果仍然不理想。

图2 菌株DN25对矿渣浸出液中游离氰的去除效果

图3 菌株DN25对矿渣浸出液中总氰的去除效果

尝试采用稀释的策略来降低矿渣浸出液中有毒物质对菌株降解活性的影响。产碱杆菌DN25对矿渣浸出液稀释液中总氰的去除效果见表3。由表3可见：当水样中初始总氰质量浓度大于10 mg/L时，总氰去除率只能维持在75%左右，这可能是由于水样中有毒物质仍然对菌株活力具有抑制作用；当初始总氰质量浓度为8.8 mg/L时，总氰去除率可提高至95.6%，反应后总氰质量浓度为0.38 mg/L，低于排放标准；然而将初始总氰质量浓度降至4.4 mg/L时，菌株也并不能将氰完全降解，初步分析认为该部分氰可能是产碱杆菌DN25所不能分解的络合氰。

2.3 菌株DN25生长及活性的影响因素

2.3.1 总氰质量浓度的影响

矿渣浸出液初始总氰质量浓度对OD600的影响见表4。由表4可见，在80 h的培养时间内各矿渣浸出液稀释液的OD600基本无变化，培养至100 h时还略有下降，说明菌株DN25在此期间基本不能增殖。

表3 产碱杆菌DN25对矿渣浸出液稀释液中总氰的去除效果

矿渣浸出液初始总氰质量浓度对游离氰质量浓度的影响见图4。

表4 矿渣浸出液初始总氰质量浓度对OD600的影响

由图4可见，各矿渣浸出液稀释液中游离氰的分解在35 h后趋于平稳， 80 h后的游离氰质量浓度分别为1.8，2.9，5.0，6.4，10.0 mg/L，游离氰去除率仅分别为50.4%、49.4%、46.1%、37.4%和28.9%，说明矿渣浸出液的条件不适合菌株生长及活性的发挥。因此考虑采用生物刺激的办法进行改善。

2.3.2 碳源的影响

由于实验菌株能以CN-为唯一氮源生长［17］，因此首先在矿渣浸出液中添加碳源葡萄糖，并监测菌株DN25的生长情况。矿渣浸出液添加碳源对OD600的影响见图5。由图5可见：当初始总氰质量浓度为5 mg/L时，菌株生长不存在停滞期，80 h后到达稳定期；初始总氰质量浓度为10 mg/L和15 mg/L时，菌体需经过24 h的停滞期才开始生长，初步分析认为停滞期是菌株自身的解毒过程；当初始总氰质量浓度为20 mg/L和30 mg/L时，菌体则需要60 h的停滞期后才开始生长，说明初始总氰质量浓度超过5 mg/L时即对菌株DN25的生长产生抑制，且随着总氰质量浓度的增大，菌株自身解毒所需时间也越长。对比表4与图5可确定，外加碳源葡萄糖对菌株DN25的生长具有一定的促进作用，这为后期构建生物反应器长效处理氰污染提供了可能。

图5 矿渣浸出液添加碳源对OD600的影响

矿渣浸出液添加碳源对游离氰质量浓度的影响见图6。由图6可见：游离氰的分解趋势与菌株的生长规律相符合，初始总氰质量浓度为10～30 mg/L时，菌株进入停滞期进行自身解毒，此时游离氰质量浓度呈下降趋势，反应24 h时游离氰质量浓度降低至5 mg/L，此时氰的抑制作用缓解，菌株开始生长；当反应时间接近60 h时，菌株对初始总氰质量浓度为10 mg/L和15 mg/L水样中的游离氰基本降解完全，初始总氰质量浓度为20 mg/L和30 mg/L水样的游离氰质量浓度分别为 2.2 mg/L和 5.5 mg/L，游离氰去除率分别为74.0%和52.6%；继续培养至102 h时，菌株将游离氰分解完全，此时矿渣浸出液中基本监测不到剩余游离氰。与图4中游离氰的分解情况对比，说明碳源对菌株DN25的降氰活性具有促进作用。

图6 矿渣浸出液添加碳源对游离氰质量浓度的影响

2.3.3 碳氮源的影响

为进一步提高菌株的生长速率、缩短氰的分解时间，在矿渣浸出液中同时添加碳源葡萄糖和氮源氯化铵。矿渣浸出液同时添加碳源和氮源对OD600的影响见图7。

图7 矿渣浸出液同时添加碳源和氮源对OD600的影响

由图7可见：同时添加碳氮源能显著促进菌株的生长，与外加碳源时相比，初始总氰质量浓度为10 mg/L和20 mg/L的矿渣浸出液中，菌株不经过停滞期直接生长；与图5相比，24 h时3种矿渣浸出液稀释液的OD600都比单独外加碳源时提高了1倍。

矿渣浸出液同时添加碳源和氮源对游离氰质量浓度的影响见图8。由图8可见：反应时间为67 h时，初始总氰质量浓度为5 mg/L和15 mg/L的矿渣浸出液的游离氰质量浓度均为0，游离氰去除率均为100%，比外加碳源时所需的时间大约缩短了7 h；初始总氰质量浓度为20 mg/L的矿渣浸出液的游离氰质量浓度为 1.3 mg/L，游离氰去除率可提高至87%。与图6相比，同时添加碳氮源的策略比单独添加碳源更能有效提高菌株的生长速率、缩短氰分解时间，为未来高效生物反应器的长效运行奠定了基础。

图8 矿渣浸出液同时添加碳源和氮源对游离氰质量浓度的影响

3 结论

a）产碱杆菌DN25可以高效去除金矿选矿废水中的氰。在反应时间为330 min时，游离氰质量浓度分别从 92.6，22.6，13.3，14.7 mg/L降至3.0，5.8，4.2，10.0 mg/L；在反应时间为23 h时，总氰质量浓度分别从162.6，32.4，21.0，22.3 mg/L降至0，0.07，0，1.24 mg/L，满足GB 8978—1996《污水综合排放标准》的要求。

b）采用产碱杆菌DN25处理矿渣浸出液。当初始总氰、游离氰质量浓度分别为96.0 mg/L 和57.2 mg/L、反应时间为分别为8 h和88 h时，处理效果不理想；当初始总氰质量浓度分别为4.4 mg/L 和8.8 mg/L、反应时间为 25 h时，处理后矿渣浸出液总氰质量浓度分别为0.37 mg/L 和0.38 mg/L，满足GB8978—1996《污水综合排放标准》的要求。

c）对矿渣浸出液中外加碳源且初始总氰质量浓度为10～30 mg/L时，产碱杆菌 DN25有24 h的生长停滞期，102 h时游离氰去除率达100%；同时投加碳氮源且总氰浓度为5～20 mg/L时，产碱杆菌DN25没有生长停滞期，67 h后游离氰的去除率达到87%以上。

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（编辑 叶晶菁）

Removal of cyanide from gold mining wastewater using Alcaligenes sp. DN25

Yin Yexing1，Li Qingyun1，2，Liu Youyan1，2
（1. School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning Guangxi 530004，China；2. Guangxi Key Laboratory of Biore fi nery，Nanning Guangxi 530003，China）

Cyanide was removed from gold mining wastewater and slag leaching solution using Alcaligenes sp. DN25. The cyanide removal effect and the factors affecting the growth and degradation activity of DN25 were investigated. The experimental results show that：When the gold mining wastewater has treated by using DN25 for 23 h，the total cyanide mass concentration is decreased from 162.6，32.4，21.0，22.3 mg/L to 0，0.07，0，1.24 mg/L，respectively；When the slag leaching solution has treated by using DN25 for 25 h，the total cyanide mass concentration is decreased from 4.4，8.8 mg/L to 0.37，0.38 mg/L，respectively；The total cyanide mass concentrations of the two kinds of wastewater both meet the national discharge standard of GB 8978-1996；Under the conditions of initial total cyanide mass concentration 10-30 mg/L and carbon source added only，DN25 can grow after a lag phase of 24 h，however，it can grow without lag phase when the initial total cyanide mass concentration is 5-20 mg/L and carbon and nitrogen sources are added.

biological treatment；gold mining wastewater；cyanide；Alcaligenes sp.

X703.1

A

1006-1878（2017）01-0049-06

10.3969/j.issn.1006-1878.2017.01.009

2016 - 05 - 17；

2016 - 09 - 14。

尹业兴（1990— ），男，广西壮族自治区百色市人，硕士生，电话 18776966944，电邮 yinyexingzou@163.com。联系人：李青云，电话 18978903227，电邮 qyli@gxu.edu.cn。

国家自然科学基金项目（51108098）。