李良军,滕 超,2,*,李秀婷,2,王中月,朱运平

(1.食品质量与安全北京实验室，北京工商大学,北京 100048;2.北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京工商大学,北京 100048)

超声耦合木聚糖酶水解棉籽壳木聚糖高效制备低聚木糖

李良军1,滕 超1,2,*,李秀婷1,2,王中月1,朱运平1

(1.食品质量与安全北京实验室，北京工商大学,北京 100048;2.北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京工商大学,北京 100048)

本研究以棉籽壳水不溶性粗木聚糖为底物,考察超声耦合酶解棉籽壳木聚糖制备低聚木糖的工艺条件。通过单因素实验以及Box-Behnken 响应面实验对低聚木糖的制备工艺进行了优化。实验结果显示,最佳超声耦合酶解条件为时间42 min,温度45 ℃,反应体系pH=5.1,超声频率40 kHz,超声强度0.22 W/cm2,还原糖总量达到最高50.46%。经HPLC分析,木二糖的含量占粗棉籽壳木聚糖的29.38%,占还原糖总量58.22%。

棉籽壳,木聚糖,低聚木糖,响应面优化

棉籽壳是我国农作物主要废弃物,存储量世界第一,但是仅有少量被有效利用[1]。据统计,2015年全国棉花总产量为560.5万吨,且有继续上升的趋势。棉籽壳作为天然纤维质材料密度小,不易运输,而且外壳坚硬,不适合作造纸原料和动物饲料,被视为废弃物,造成资源和经济的巨大损失,同时对环境造成污染[2]。因此寻求棉籽壳合理有效的利用方式成为当前迫切需要解决的问题。

低聚木糖近些年已经作为重要的功能性添加剂被广泛用于多种食品中,它可直接进入肠道优先被双歧杆菌等益生菌利用而快速增殖,进而抑制有害菌生长,而且其功效性是其他聚合糖类的近20倍,并对防治高血压和动脉硬化以及抗衰老、预防癌症和抑制肿瘤具有很好的效果[3-5]。超声波技术作为一种高效且对环境友好的制备手段,在食品加工、化工、医疗、生物工程等领域应用广泛[6-7],尤其通过与酶解反应的技术耦合在生物催化领域得到了快速发展,并日益受到人们的重视[8]。当前研究已经初步证实,超声波可以促进底物分子之间的相互作用,强化反应物进入及生成物离开酶活性中心的过程,从而提高酶的催化活性[9]。国内外主要集中在超声耦合从原料中提取木聚糖的研究,提高木聚糖的提取率,而本研究是考察超声耦合酶解过程来提高低聚木糖的得率,优化了棉籽壳中低聚木糖的制备条件,提升棉籽壳的利用价值,为提高低聚木糖的转化效率提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

棉籽壳 市售,产地新疆,粉碎粒度70～130目;木聚糖酶F1208 为本实验室保藏菌株嗜热踝节菌F1208发酵纯化获得,酶活为100 U/mL;D-木糖、对硝基苯酚等试剂 均为国产分析纯。

DTD5200S超声波清洗机 北京弘祥隆生物技术有限公司;Agilent 1200型高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司;Sugar-D分析柱 日本Shodex公司;WFJ2000型可见分光光度计 龙尼柯(上海)仪器有限公司;HH-4恒温水浴锅 江苏金坛宏华仪器厂;GL-20G-H型离心机 上海安亭科学仪器厂;XMTD-8222型电热恒温鼓风干燥箱 上海博讯实业机械有限公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 木聚糖的提取 本实验以棉籽壳为原料提取木聚糖,具体方法参照李秀婷[10]等。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 反应体系pH对还原糖转化率的影响 设定超声时间为30 min,超声温度为40 ℃,超声频率为40 kHz,超声强度为0.13 W/cm2,考察反应体系pH分别为3.5、4.0、4.5、5.0、5.5时超声耦合酶解棉籽壳木聚糖时还原糖转化率的变化。加酶量为15 U/mL,底物为0.1 g棉籽壳水不溶性木聚糖。超声结束后沸水浴5 min,冷却后离心,DNS比色法测定其还原糖总量。

1.2.2.2 超声时间对还原糖转化率的影响 设定反应体系pH为5.0,超声温度为40 ℃,超声频率为40 kHz,超声强度为0.13 W/cm2,考察超声时间分别为10、20、30、40、50、60 min时超声耦合酶解棉籽壳木聚糖时还原糖转化率的变化,其他操作同1.2.2.1。

1.2.2.3 超声温度对还原糖转化率的影响 设定反应体系pH为5.0,超声时间为40 min,超声频率为40 kHz,超声强度为0.13 W/cm2,考察超声温度分别为35、40、45、50、55 ℃时超声耦合酶解棉籽壳木聚糖时还原糖转化率的变化,其他操作同1.2.2.1。

1.2.2.4 超声频率对还原糖转化率的影响 设定反应体系pH为5.0,超声时间为40 min,超声温度为45 ℃,超声强度为0.13 W/cm2,考察超声频率分别为28、40、50、135 kHz时超声耦合酶解棉籽壳木聚糖时还原糖转化率的变化,其他操作同1.2.2.1。

1.2.2.5 超声强度对还原糖转化率的影响 设定反应体系pH为5.0,超声时间为40 min,超声温度为45 ℃,超声频率为50 kHz,考察超声强度分别为0.04、0.13、0.22、0.31、0.40 W/cm2时超声耦合酶解棉籽壳木聚糖时还原糖转化率的变化,其他操作同1.2.2.1。

1.2.3 响应面分析 根据单因素优化实验结果,选择超声时间、超声频率、反应体系pH(如表1所示)三因素为自变量,还原糖的转化率为响应值,对超声耦合酶解条件做进一步优化。利用Design-Expert软件设计组合实验,采用Box-Benhnken中心组合设计原理设计三因素三水平共17个实验点的响应面分析实验。

表1 中心组合(Box-Behnken)设计因素编码、水平Table 1 Experimental range,level and code of independent variables table for the optimization of xylanase production

1.2.4 酶解产物还原糖含量的测定 还原糖含量的测定采用DNS比色法[11]。取0.1 mL木聚糖酶水解液加入450 μL缓冲液、450 μL背景溶液和1 mL DNS试剂,沸水浴中煮沸5 min后显色,然后迅速用流水冷却,加入1 mL酒石酸钾钠溶液护色,540 nm波长处测定吸光度,以木糖浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标绘制木糖标准曲线,并得出标准方程Y=0.07505X+0.00424(R2=0.998)。

还原糖转化率(%)=酶解液中还原糖含量(g)/棉籽壳木聚糖底物(g)×100

1.2.5 酶解产物HPLC分析 水解液中木寡糖采用HPLC法定量[12]。实验条件:流动相为高纯水,流速为1.0 mL/min,柱温箱温度30 ℃,示差折光检测器温度40 ℃,进样量20 μL。

木糖(木二糖、木三糖)标准曲线的制作:称取1.0 g木糖(木二糖、木三糖)标准品,用高纯水定容至100 mL,配制成质量分数为1.0%(10.0 mg/mL)的溶液。然后将1.0%的木糖(木二糖、木三糖)溶液进行稀释分别配制不同浓度(0.6%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%)的木糖(木二糖、木三糖)标准溶液,进行HPLC分析,以峰面积(×105)为纵坐标,木糖(木二糖、木三糖)浓度为横坐标制备木糖(木二糖、木三糖)标准曲线,并分别得出木糖标准方程Y=15.7X-2.15(R2=0.998);木二糖标准方程Y=17.3X+0.95(R2=0.994);木三糖标准方程Y=14.8X+2.99(R2=0.998)。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 反应体系pH对还原糖转化率的影响 由图1可以看出,随着反应体系pH的增加,还原糖转化率迅速增加,当pH=5时,还原糖转化率达到最高值,为32.74%。而pH>5时,还原糖转化率与反应体系pH呈负相关。

图1 反应体系pH对还原糖转化率的影响Fig.1 Effect of ratereaction system pH on the reducing sugar conversion rate

2.1.2 超声时间对还原糖转化率的影响 由图2可以看出,超声时间在未达到40 min时,还原糖转化率随着超声时间的增加呈上升趋势;超声时间40 min时还原糖的转化率达到45.36%,随后趋于稳定。

图2 超声时间对还原糖转化率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic time on the reducing sugar conversion rate

2.1.3 超声温度对还原糖转化率的影响 由图3可以看出,还原糖转化率随超声温度的升高而迅速增加,当温度达到45 ℃时,还原糖的转化达到最高,为45.32%,而后转化率逐渐下降。在超声耦合酶水解反应过程中,其中最关键的两个因素是空化效应和热效应。当反应温度较低时,热效应为主导因素,超声波将能量传递给整个反应体系,从而加速了酶解速率。随着温度继续增加,空化效应为主导因素,液体微泡的破裂会伴随着能量的释放,同时伴随产生的自由基很可能会攻击酶的活性中心,从而破坏酶分子的构象,进而导致酶解速率降低,使得还原糖转化率逐渐下降[13]。

图3 超声温度对还原糖转化率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the reducing sugar conversion rate

2.1.4 超声频率对低聚木糖转化率的影响 由图4可以看出,超声频率对木聚糖酶的酶解促进作用比较明显,还原糖转化率从28～50 kHz逐渐增加,超声频率为50 kHz时还原糖转化率达到峰值,为49.88%。随着超声频率继续增加,还原糖转化率呈现下降趋势。朱少娟等[14]研究表明,超声频率较低时,超声波所产生的能量场增加了木聚糖酶与木聚糖的接触面积,从而加快了酶解速率;频率增加到某一特定值时,超声波可能使酶的活性中心暴露到最大,底物结构更松散,促进酶与底物的结合,使还原糖转化率达到最大。当超声频率继续增加后,超声波的能量场过于强烈,破坏了酶分子的构象,使酶的活性中心受到破坏,从而导致酶活性降低,降低了反应速率。

图4 超声频率对还原糖转化率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic frequency on the reducing sugar conversion rate

2.1.5 超声强度对低聚木糖转化率的影响 由图5可以看出,还原糖的转化率随着超声频率的增加而增加,当超声强度为0.22 W/cm2时,还原糖的转化率达到最高,为48.62%。而后随着超声强度继续增加,还原糖得率逐渐下降。在不同的超声强度下对酶分子的构象产生不同的变化。王振斌等[15]研究中发现,在较低的超声强度下,使酶分子的能量增加和介质温度提升,引起酶分子构象的微小变化,使酶分子的超微结构更具柔性、更合理,从而表现出较高的催化活性。在较高的超声强度下,酶分子的能量进一步加大,构象逐渐趋向于不合理,使酶分子的催化活力遭到破坏,甚至使酶失活,进而降低酶解反应速率。

图5 超声强度对还原糖转化率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic intensity on the reducing sugar conversion rate

2.2 响应面优化

表3 回归方程的变量分析表Table 3 Multivariate analysis table of the regression equation

注:*:差异显著(p<0.05);**:差异极显著(p<0.01)。

利用Design-Expert软件对响应值进行二次多项回归拟合,获得木二、木三糖占总还原糖比例对超声时间(A)、超声频率(B)、反应体系pH(C)的二次多项回归方程为:Y=49.87+0.97A+4.17B+3.26C-0.25AB+0.55AC+1.07BC-2.94A2-11.97B2-6.70C2

表2 中心组合设计及结果Table 2 Design and result of Box-Benhnken experiment

根据表3可以看出,模型的p<0.01,为极显著,失拟项的p>0.05,为不显著,实验误差小,说明模型拟合非常可靠。方差结果还表明方程一次项(B、C)、二次项(B2、C2)的影响都是显著的,其中B、B2、C2的影响是极显著的,因此各实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系,表明回归模型的意义和真实性良好。各因素间交互作用的响应面图见图6。

图6 各因素间交互作用的响应面图Fig.6 Response surface of interaction between various factors

经响应面优化,模型预测最佳棉籽壳低聚木糖的制备条件为:超声时间41.81 min,超声频率41.03 kHz,反应体系pH5.1,反应温度45 ℃,超声强度0.22 W/cm2,在此条件下预测的还原糖转化率为50.77%。对模型进行验证,考虑实验的可操作性,将最佳超声酶解条件调整为:超声时间:42 min,超声频率:40 kHz,反应体系pH5.1,反应温度45 ℃,超声强度0.22 W/cm2。经过3次平行实验验证,确定实际还原糖转化率为50.46%,实际值与预测值之间差异小于1%,说明此模型的预测是可靠的。

2.3 酶解产物液相分析

由图7可知,超声耦合酶水解液中含有木糖、木二糖、木三糖以及少量的其他低聚木糖,其中木二糖的含量最高,木糖含量非常少,木二糖含量占粗棉籽壳木聚糖29.38%,占总还原糖的58.22%。

图7 超声耦合酶水解液的HPLC图Fig.7 HPLC of ultrasound-coupled enzymatic hydrolysate

3 结论

通过单因素及Box-Behnken Design响应面优化实验,对超声耦合酶解条件进行了优化,优化得到的最佳条件为:超声时间42 min,超声频率:40 kHz,反应体系pH5.1,反应温度45 ℃,超声强度0.22 W/cm2,还原糖转化率为50.46%,木二糖占粗棉籽壳木聚糖的29.38%,占总还原糖的58.22%,其产物中木二糖含量处于较高水平,且木糖的含量极少,可以作为提取高纯度的木二糖原料,对指导工业中更好地利用棉籽壳废弃物等具有重大的意义。

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Preparation of xylooligosaccharides from cottonseed husk by ultrasound-coupled enzymatic hydrolysis

LI Liang-jun1,TENG Chao1,2,*,LI Xiu-ting1,2,WANG Zhong-yue1,ZHU Yun-ping1

(1.Beijing Laboratory of Food Quality and Safety,Beijing Technology & Business University(BTBU),Beijing 100048,China;2.Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology & Business University(BTBU),Beijing 100048,China)

The study focused on ultrasound-coupled enzymatic hydrolysis to produce xylooligosaccharides from cottonseed husk by response surface methodology. The conditions of ultrasound-coupled enzymatic hydrolysis were optimized by response surface methodology,and its mathematical model was established. Results showed that the optimal parameters of ultrasound-coupled enzymatic hydrolysis were as follows:the initial pH5.1,hydrolysis time 42 min,temperature 45 ℃,ultrasonic frequency 40 kHz,ultrasonic intensity 0.22 W/cm2. Under the optimal conditions,the conversion ratio of reducing sugar reached 50.46%. Moreover,the components of ultrasound-coupled enzymatic hydrolysis were measured by HPLC,the conversion ratio of xylobiose was 29.38%,accounted for 58.22% of the total reducing sugar.

cottonseed husk;xylan;xylooligosaccharides;response surface analysis

2016-07-25

李良军(1991-)，男，硕士研究生，研究方向：微生物与酶工程， E-mail：liljbtbu@163.com。

*通讯作者:滕超(1981-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技术，E-mail：tc2076paper@163.com。

国家自然科学基金项目(31201449)；国家自然科学基金项目(31371723)。

TS201.3

A

:1002-0306(2017)04-0186-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.04.027