徐 阳，王 军

桃核承气汤对大鼠糖尿病大血管Toll样受体表达的影响

徐 阳，王 军

目的：观测桃核承气汤早期干预对糖尿病鼠大血管病变中TOLL样受体2（TLR-2）、TOLL样受体4（TLR-4）及转化生长因子(TGF-β)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)表达的影响。方法：雄性SD大鼠130只，正常对照组（A组）30只，其余100只制造糖尿病模型，分为模型对照组（B组）、中药早期干预组（C组）及中药治疗组（D组）。A组不予药物干预；B组给予0.9%氯化钠10 mL·Kg-1·d-1灌胃；C组自造模前予桃核承气汤水溶液灌胃0.9 g·Kg-1·d-1，造模后继续给予桃核承气汤0.9 g·Kg-1·d-1灌胃；D组造模后给予桃核承气汤0.9 g·Kg-1·d-1灌胃。药物干预第1、12、20周处死，分别取材。免疫组化法检测糖尿病大鼠大血管中TLR-2、TLR-4、TGF-β、IGF-1表达情况。结果：药物干预20周后C组大鼠股动脉TLR-2为（3.750±1.282）pg/mL，较B组[（9.333±2.338）pg/mL]明显降低（P＜0.05），D组与B组大鼠股动脉TLR-2表达无明显差异（P＞0.05）。C组及D组大鼠股动脉TLR-4表达为（3.750±1.282）pg/mL、（5.750±1.982）pg/mL，较B组[（10.333±2.658）pg/mL]明显降低（P＜0.05），且C组对大鼠股动脉TLR-4表达干预作用强于D组（P＜0.05）。随着用药时间延长，C组与D组大鼠股动脉TLR-2、TLR-4表达干预作用趋于相近（P＞0.05）。大鼠股动脉TGF-β C组为(403.438±11.273)pmol/L，D组为(535.313±12.384)pmol/L，均明显降低（P＜0.05）；IGF-1 C组为(1104.375±55.495)pmol/L，D组为（861.000±28.656），均有明显升高（P＜0.05），且C组作用较D组强。结论:中药桃仁承气汤可减轻糖尿病大血管纤维化，且早期干预对糖尿病大血管纤维化有预防作用。

大血管纤维化；早期干预；Toll样受体；转化生长因子β；胰岛素样生长因子1

糖尿病的发病率在全球呈快速增长趋势，已经成为一大严重影响人类生命质量的慢性疾病。糖尿病血管病变是糖尿病的主要并发症之一，是致死、致残的首要原因。大量研究表明，糖尿病大血管病变后可逆性差，故早期干预预防大血管病变的发生发展对于本病至关重要。桃核承气汤原方出自张仲景《伤寒论》，用于治疗中医下焦蓄血症。临床报道的蓄血症的表现涉及病种很繁杂，目前多数研究认为其与血管内皮损伤有关。我们的前期研究证实，桃核承气汤可降低糖尿病大鼠大动脉TGF-β、结缔组织生长因子（CTGF）、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子（VEGF）以及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的表达，能够较为有效的抑制糖尿病大血管病变向纤维化发展[1-2]。本研究通过对实验性糖尿病大血管病变大鼠进行早期中药干预，探讨桃核承气汤早期干预预防大血管病变的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：清洁级雄性SD大鼠130只，2月龄，体质量160～200 g，平均（187.46±14.52）g。由天津实验动物中心提供。

药物：桃核承气汤(桃仁∶大黄∶桂枝∶甘草∶芒硝= 2∶2∶1∶1∶1)，由天津中医药大学颗粒剂药房制作，每克颗粒剂相当于生药10 g。根据人与大鼠体表面积换算，人桃仁用药剂量为30 g时，大鼠的用药剂量约为0.90 g·kg-1·d-1。0.9%氯化钠：天津大家制药有限公司生产。精蛋白锌胰岛素注射液：400 IU/瓶，由江苏万邦生化医药有限公司生产。

仪器：德国罗氏活力型血糖仪。稳压电泳仪，六一仪器，北京。高速离心机，Sigma，美国。水浴箱，精宏实验设备有限公司，上海。干燥消毒烤箱(DHG-9246A)，精宏试验设备有限公司，上海。台式离心机，Eppendorf公司，德国。转膜仪，六一仪器，北京。灌胃针、注射器(l mL、5 mL、10 mL)、10 mL玻璃瓶、止血钳、直剪、试管、吸管等。

试剂：TLR-2一抗：Abcam，英国；TLR-4一抗：Abcam，英国；RatTGF-βElisa kit：Geneway，美国；Rat IGF-1Elisa kit Geneway，美国。

1.2 分组 造模前分为正常对照组（A组，n=30）、实验组（n=100）制造糖尿病模型。考虑STZ腹腔注射造糖尿病模型有意外死亡及造模不成功可能，在100只实验组大鼠中随机选取34只作为早期干预组（C组），造模同时给予桃核承气汤0.9 g·Kg-1·d-1灌胃，其余66只随机分为模型对照组（B组）及中药治疗组（D组）。造模意外死亡大鼠3只，另4只大鼠未成模，剔除实验。最终实验动物数量：B组31只，C组31只，D组31只。

1.3 干预方法 所有大鼠适应性喂养2周，A组继续予普通饲料喂养，B、C、D组高脂高糖喂养，诱导胰岛素抵抗。4周后，B、C、D组均采用STZ腹腔注射造糖尿病模型。稳定血糖1周，维持非禁食状态血糖25.0 mmol/L左右，B、C、D组共93只大鼠成功制成糖尿病模型。

A组不予药物干预。B组自造模成功，给予0.9%氯化钠10 mL·kg-1·d-1灌胃。C组自造模前予桃核承气汤0.9 g·kg-1·d-1灌胃，造模后继续予桃核承气汤0.9 g·kg-1·d-1灌胃。D组自造模成功给予桃核承气汤0.9 g·kg-1·d-1灌胃。连续药物干预第1、12、20周，按计划处死大鼠。各组分别取材，保存标本。

1.4 取材方法 分别于第1、12、20周，每组随机选取10只大鼠（若实验过程中出现动物死亡造成标本数量不足，按实际情况减少标本数量）。禁食24 h，用10%的水合氯醛0.3 g/100 g麻醉。将大鼠仰卧位固定在大鼠固定板上，用清水湿润股内侧及腹股沟区的鼠毛，再用剪子剪去鼠毛进行备皮，常规消毒。根据股动脉搏动情况确定股动脉的位置和走行方向，沿股动脉走向纵向切开皮肤，用蚊式钳钝性分离组织，以暴露股动脉鞘。分离时动作要轻柔，不得用刀剪等锐利器械，以防损伤血管和神经。股动脉鞘内有并行的股动脉、股静脉、股神经，直径由粗到细，其中呈粉红色且触之有搏动的粗大血管即为股动脉。用眼科镊顺着血管走向钝性分离股动脉约4～5 cm，两端剪断。PBS(磷酸盐缓冲液)冲洗，平均分成两部分，一部分采用4%多聚甲醛进行固定，另一部分置于无菌冻存管中，-80℃冰箱保存。

1.5 标本TLR-2、TLR-4免疫组化检测 标本固定、包埋、切片。用4%多聚甲醛进行固定，经70%～100%乙醇、二甲苯透明、55℃石蜡、用铜制模具包埋组织块。将厚度5 μm的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，60℃过夜。脱蜡：组织玻片置于二甲苯中浸泡。后水化、抗原煮沸热修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育后DAB显色：按DAB显色试剂盒操作说明显色，镜下掌握显色程度。自来水冲洗。复染：苏木素复染30 s到1 min，自来水冲洗。分化：1%盐酸酒精分化1 s，饱和碳酸锂溶液返蓝。脱水：梯度乙醇分别浸泡10 min。透明：组织切片置于二甲苯中浸泡10 min，更换二甲苯后再浸泡10 min。封片：滴加1滴中性树胶，盖玻片从一端倾斜盖下，防止气泡产生。显微镜观察。

镜观采相分析：以胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。定量分析采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统，每张切片在高倍镜下(×400)随机选取10个视野并摄像保存，采用IMAGE PRO PLUS软件设置阳性表达的宏程序。在同一条件下，分析不同组别的TLR-2、TLR-4含量，对阳性表达率进行组间比较。

1.6 标本TGF-β、IGF-1酶联免疫吸附试验（ELISA）检测 样品准备：取出标本置于含有PBS的匀浆器中，放置冰上小心研碎并提取蛋白。Elisa检测TGF-β及IGF-1表达：（1）加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μL，余孔分别加标准品或待测样品100 μL。（2）弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100 μL。（3）温育60 min，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，300 μL/孔，甩干。（4）每孔加准备好的ABC溶液100 μL。（5）弃去孔内液体，甩干。（6）依序每孔加TMB底物溶液90 μL。37℃避光显色。（7）依序每孔加终止液100 μL，终止反应。（8）用酶联仪在450 nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后15 min以内进行检测。

结果判断：（1）每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。（2）以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。由标本的OD值在标准曲线上查出其浓度。（3）计算浓度时乘以稀释倍数。浓度单位为pg/mL。

1.7 统计学处理 所有统计计算均用SAS v9.1.3统计分析软件进行，计量资料以均数±标准差()表示，采用方差分析，两两比较采用LSD检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验过程中各组死亡大鼠共12只：A组1只，B组5只，C组3只，D组3只。实验结束时各组实验大鼠数量：A组9只，B组6只，C组8只，D组8只。

2.1 大鼠股动脉TLR-2免疫组化检测分析 实验第1周第12周，C组大鼠股动脉TLR-2表达较B组明显降低，D组与B组大鼠股动脉TLR-2表达无明显差异。表明早期干预可减低大鼠股动脉TLR-2表达。实验第20周，C组大鼠股动脉TLR-2与D组无明显差异。说明随着用药时间延长，D组与C组对大鼠股动脉TLR-2表达干预作用相近（见表1）。

2.2 大鼠股动脉TLR-4免疫组化检测分析 实验第1周，C组及D组大鼠股动脉TLR-4表达较B组均明显降低，C组与D组对大鼠股动脉TLR-4干预无明显差别。实验第12周，C组及D组大鼠股动脉TLR-4表达较B组均明显降低，且C组对大鼠股动脉TLR-4表达干预作用强于D组。实验至第20周，D组与C组对大鼠股动脉TLR-4表达干预作用趋于相近（见表2）。

2.3 大鼠股动脉TGF-β检测分析 用药后，自第1周起C组及D组大鼠股动脉TGF-β均有明显降低，且C组对大鼠股动脉TGF-β降低作用较D组强（见表3）。

2.4 大鼠股动脉IGF-1检测分析 用药后，自第1周起C组及D组大鼠股动脉IGF-1均有明显升高，且C组对大鼠股动脉IGF-1升高作用较D组强（见表4）。

表1 鼠股动脉TLR-2免疫组化检测（）

表1 鼠股动脉TLR-2免疫组化检测（）

第1周 第12周 第20周A组B组C组D组n 10 10 10 10 1.000±0.667 7.800±1.549a3.400±0.966a、b6.900±2.025a、cn 10 10 10 10 1.300±0.483 8.100±2.025a2.800±1.033a、b4.800±1.398a、cn9 6 8 8 1.333±0.500 9.333±2.338a3.750±1.282a、b4.625±2.560a

注：与A组同时间比较组比较，aP＜0.05；与B同时间比较组比较，bP＜0.05；与C组同时间比较，cP＜0.05

表2 大鼠股动脉TLR-4免疫组化检测分析（）

表2 大鼠股动脉TLR-4免疫组化检测分析（）

注：与A组同时间比较组比较，aP＜0.05；与B同时间比较组比较，bP＜0.05；与C组同时间比较，cP＜0.05

第1周 第12周 第20周A组B组C组D组n 10 10 10 10 1.100±0.568 7.500±1.581a3.000±1.054a、b4.500±1.841a、bn 10 10 10 10 1.100±0.568 9.100±2.283a3.400±0.966a、b4.200±1.135a、b、c n9 6 8 8 1.778±1.302 10.333±2.658a3.750±1.282a、b5.750±1.982a

表3 大鼠股动脉TGF-β检测结果（pmol/L）（）

表3 大鼠股动脉TGF-β检测结果（pmol/L）（）

注：与A组同时间比较组比较，aP＜0.05；与B同时间比较组比较，bP＜0.05；与C组同时间比较，cP＜0.05

第1周 第12周 第20周A组B组C组D组n 10 10 10 10 169.950±5.134 703.750±26.762a435.950±19.783a、b 570.150±15.474a、b、c n 10 10 10 10 165.150±9.716 880.800±15.550a378.750±10.652a、b 535.100±24.479a、b、c n9 6 8 8 282.500±7.084 1049.333±27.424a403.438±11.273a 535.313±12.384a、b、c

表4 大鼠股动脉IGF-1检测结果（pmol/L）（）

表4 大鼠股动脉IGF-1检测结果（pmol/L）（）

注：与A组同时间比较组比较，aP＜0.05；与B同时间比较组比较，bP＜0.05；与C组同时间比较，cP＜0.05

第1周 第12周 第20周A组B组C组D组n 10 10 10 10 1439.500±70.834 629.400±30.358a925.000±23.650a、b722.300±18.583a、b、c n 10 10 10 10 1458.500±40.478 452.400±49.896a1082.700±47.542a、b785.500±38.659a、b、c n9 6 8 8 1481.667±45.238 378.000±25.822a1104.375±55.495a、b861.000±28.656a、b、c

3 讨论

研究发现，TGF-β1、CTGF、胶原蛋白I、胶原蛋白III均在中、晚期糖尿病大鼠的大血管中显著增加，提示糖尿病大血管病变可能与纤维化有关。TLR-2和TLR-4在介导肾[3]、心[4]、肝[5]、肺[6]、皮肤等多种组织器官纤维化进程中起十分重要的作用，可能是最主要的致纤维化细胞因子[7-8]。其在动脉纤维化过程中可能起着“分子开关”的重要作用[9-10]，是研究器官组织纤维化的热门因子[11]。TGF-β被认为是迄今最强的细胞外基质沉积促进剂，是纤维化疾病发病过程中起核心作用的细胞因子。其可使细胞外基质降解受抑制，沉积增加，最终导致血管纤维化[12-13]。IGF是一类多功能细胞增殖调控因子，IGF-1具有促细胞促有丝分裂，促进细胞的增殖与分化，抑制细胞凋亡的作用。已有充分研究表明，IGF-l对成纤维细胞、成骨细胞、平滑肌细胞等有直接的促增殖作用，并能促进胶原合成，而且还能作为一种促进因子，增强其它与纤维增生有关的细胞因子如TGF-β、CTGF、PDGF等的作用[14]。

本研究发现，用药后C组大鼠股动脉TLR-2表达较B组明显降低，D组与B组大鼠股动脉TLR-2表达无明显差异，用药后C组及D组大鼠股动脉TLR-4表达较B组均明显降低，且C组对大鼠股动脉TLR-4表达干预作用强于D组。但随着用药时间延长，C组与D组大鼠股动脉TLR-2、TLR-4表达干预作用趋于相近。用药后C组及D组大鼠股动脉TGF-β均有明显降低，IGF-1均有明显升高，且C组作用较D组强。结果表明，中药桃仁承气汤可减轻糖尿病大血管纤维化，且早期干预对糖尿病大血管纤维化有预防作用。

“治未病”思想源自《黄帝内经》，历代医家乃至现代医学对“治未病”思想都极为重视。《素问·四气调神大论》中提出：“是故圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱，此之谓也。夫病已成而后药之，乱已成而后治之，譬犹渴而穿井，斗而铸锥，不亦晚乎”，就生动地指出了“治未病”的重要意义。通过本实验可以看出，早期使用中药干预对糖尿病大血管纤维化有明显的预防作用，能有效缓解糖尿病血管病变的发生发展。其对于临床糖尿病大血管病变患者的疾病预防有较好的指导意义。

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（收稿：2016-06-26 修回：2016-11-22）

（责任编辑 刘洪斌 屈振亮）

数字的具体要求

表示特定起点与终点定界的时间段时，起点与终点之间以一字线即“—”为分隔符，而不再用波纹线即“～”表示，如2008—2011年(不再用2008～2011年)。除上述时间段之外的其他计数、计量范围的表示，仍然用波纹线“～”，如2～6 kg。表示百分数的范围和偏差时，前一个数字的百分符号不能省略，如：5%～95%不能写成5～95%，（50.2±0.6）%不能写成50.2±0.6%，37℃± 1℃不能写成37±1℃。附带尺寸单位的数值相乘，按下列方式书写：4 cm×3 cm×5 cm，不能写成4×3×5 cm3。幂次相同的参数范围，前一个参数的幂次不能省略，如3×109～5×109不能写成3～5×109，但可写成(3～5)×109。数字的有效位数一般按标准差的1/3来确定，如(3.6±0.42)kg，标准差的1/3为0.14，有效位数在小数点后1位，故应取小数点后1位，即(3.6±0.4)kg；又如(8.61±0.27)cm，标准差的1/3为0.09，有效位数在小数点后2位，故应取小数点后2位，即(8.61±0.27)cm。百分数的有效位数要以分母确定：分母＜10，不用百分数表示，宜用分数表示，如5/7；分母10～99，百分数到个位，如57%；分母100～999，百分数到数点后1位，如57.0%，其余以此类推。

The Effect of Tao-He-Cheng-Qi Decoction on Vascular Expression of Toll-like Receptor 2,Toll-like Receptor 4,Transforming Growth Fator-beta and Insulin-like Growth Fator-1 in Rats with Diabetes

XU Yang,WANG Jun. Department of Surgery,First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin(300193),China

ObjectiveTo observe the effects of Tao-He-Cheng-Qi decoction on rat vascular expression of toll-like receptor-2(TLR-2),TLR-4,transforming growth factor-beta(TGFβ),and insulin-like growth factor-1 (IGF-1)expression.MethodsMale SD rats were divided to a control group(A group,n=30),a model group (B group,n=31),an early-treatment group(C group, n=31)and a regular-treatment group(D group,n= 31).Rats in A group had no drug intervention,but re-ceived 0.9%sodium chloride(10 mL/kg)gavage everyday in rats of B group.Rats in C group were received Tao-He-Cheng-Qi decoction by gavage before and after diabetic modeling.The rats of D group were received Tao-He-Cheng-Qi decoction after diabetes modeling.After 1,12,or 20 weeks of intervention,rats were sacrificed.Immunohistochemical methods were used to detect the expression of TLR-2,TLR-4,TGFβ and IGF-1 in large blood vessel.ResultsTwenty weeks after intervention,the levels of TLR-2 expression were(9.333± 2.338)pg/mL in D group,but significantly decreased in C group(3.750±1.282 pg/mL,P＜0.05).The levels of TLR-2 expression were not different between D and B group.The levels of TL-4 expression were(3.750± 1.282)pg/mL in C group and(5.750±1.982)pg/mL in D group,which was significantly decreased compared to that in B group(10.333±2.658 pg/mL,P＜0.05).The expression levels of TGF-beta was(403.438± 11.273)pmol/L in C group and(535.313±12.384)pmol/L in D group,with significant difference(P＜0.05).The expression levels of IGF-1 were(1104.375±55.495)pmol/L in C group and(861.000±28.656)pmol/L in D group.The difference was significant(P＜0.05).ConclusionTao-He-Cheng-Qi decoction can reduce diabetic vascular fibrosis,and also can prevent diabetic vascular fibrosis when early intervention.

Macrovascular fibrosis;early intervention;toll-like receptor;transforming growth factor-beta; insulin-like growth factor 1

Q95-33；R654.4

A

1007-6948(2017)01-0060-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.01.017

国家自然科学基金面上项目（81173268）

天津中医药大学第一附属医院外一科（天津 300193）

王军，E-mail：tjzywangjun@126.com