江娜 张金华 王湘宁 刘志平 徐莹

430010湖北省武汉市汉口医院

胆宁片对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝大鼠SOD、MDA的影响

江娜 张金华 王湘宁 刘志平 徐莹

430010湖北省武汉市汉口医院

目的：探讨胆宁片对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝大鼠SOD、MDA的影响。方法：SD大鼠53只，首先随机分为两组，正常组10只和模型组43只。通过高脂饮食诱导的方式复制非酒精性脂肪肝大鼠模型。造模第2周起每隔1周随机处死模型组中1只大鼠观察造模情况，于4周后确定造模成功，处死正常组10只，剩余40只模型组大鼠随机分为4组：模型组、胆宁片组、绞股蓝组、多烯磷脂酰胆碱组。各组分别予以相应剂量的药物灌胃治疗。连续给药4周后处死大鼠，生化法检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)，比色法检测肝组织匀浆中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量。结果：治疗结束后，与模型组比较，胆宁片组能有效改善大鼠肝脏病理学状态(P＜0.05)；与模型组比较，胆宁片组大鼠血清中的血脂有不同程度的下降(P＜0.01，P＜0.05)；胆宁片组肝组织MDA含量下降(P＜0.01)、SOD含量升高(P＜0.01)，其中在升高SOD方面优于多烯磷脂酰胆碱组及绞股蓝组(P＜0.01)。结论：胆宁片对改善高脂饮食诱导的NAFLD大鼠具有保护作用。

非酒精性脂肪肝；大鼠；胆宁片；SOD；MDA

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征[1]，现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，欧美国家成人脂肪肝患病率从20世纪80年代的10%上升到目前的31%[2]。胆宁片由大黄、虎杖、青皮、白茅根、陈皮、郁金、山楂组成，该药临床已经作为治疗慢性胆囊炎、胆囊结石以及发展成为治疗习惯性便秘的有效药物；目前在临床的应用中，发现该药对治疗NAFLD有一定的疗效，因其有价格低廉、安全性高、疗效显著等特点[3]，部分学者已经将其作为治疗NAFLD的常用药。本实验采用高脂饮食喂养的方式诱导NAFLD的方式，观察胆宁片对高脂饮食诱导大鼠NAFLD血脂、肝功能的影响，并通过检测肝组织中SOD、MDA的变化，研究胆宁片对NAFLD大鼠肝脏的保护作用，现报告如下。

资料与方法

动物SD大鼠，SPF级，雄性数量53只，重量180～220 g。

药品及试剂：胆宁片配制成56.25 mg/mL的溶液，绞股蓝总苷片配制成1.875 mg/mL的溶液，多烯磷脂酰胆碱胶囊配制成14.25 mg/mL的溶液。高脂饲料(配方：猪油10%，蛋黄粉5%，胆固醇1%，丙硫氧嘧啶0.2%，脱氧胆酸钠0.5%，蔗糖5%，基础饲料78.3%；固体饲料的制备：将各成分按比例计算出所需量)。SOD、MDA试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

方法：①模型的制备、分组及给药：正常组给予正常饲料进行喂养，模型组给予高脂肪饲料进行喂养，持续4周的时间，每周处死1只模型组大鼠，观察造模情况。于造模4周后，将正常组10只和模型组3只大鼠进行处死。对两组大鼠的肝组织病理切片及肝组织生化进行检测。造模成功标准：模型组大鼠肝脏30%以上的肝细胞均已形成大泡伴小泡性脂肪变性及肝脏脂肪含量水平上升[4]。造模结束后，将另40只模型组大鼠随机均分为4组：模型组：灌胃生理盐水10 mL/(kg·d)、胆宁片组：灌胃胆宁片562.5 mg/(kg·d)、绞股蓝组：灌胃绞股蓝溶液18.75 mg/(kg·d)、多烯磷脂酰胆碱组：灌胃多烯磷脂酰胆碱溶液142.5 mg/(kg·d)。治疗4周后，将所有大鼠进行处死，采集血液和肝脏标本。②比色法测定肝组织MDA、SOD的含量：MDA测定：精确称取肝脏300 mg，加入预冷的2 700 μL生理盐水中，在冰水中制成10%的匀浆，4℃3 000转离心10 min，提取上清液测定MDA含量。计算公式：组织匀浆中MDA含量=(测定管OD值-测定空白管OD值)/(标准管OD-标准空白管OD)×标准品浓度÷待测样品蛋白浓度。SOD测定：同样步骤制成10%的匀浆，然后从中取出10 μL，加入另一100 μL的生理盐水，制备成1%的组织匀浆。4℃3 000转离心10 min，提取上清液测定SOD含量。组织匀浆中SOD含量=(对照OD值-测定OD值)/对照OD÷50%×(反应应液总体/取样样)÷待测样品蛋白浓度。统计学方法：所有数据采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，计量资料用(±s)表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验；P＜0.05为差异具有统计学意义。

胆宁片对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠肝指数的影响：肝指数=肝湿重/体重×100%，见表1。与正常组比较，模型组大鼠肝脏指数明显升高(P＜0.01)；胆宁片组可明显降低NAFLD大鼠肝脏指数。

结果

表1 各组大鼠肝指数的比较(±s)

表1 各组大鼠肝指数的比较(±s)

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，⋆P＜0.05。

组别 动物数 肝指数(%)正常组 8 2.94±0.41模型组 8 3.75±0.26##胆宁片组 8 3.24±0.24⋆绞股蓝组 8 3.48±0.20多烯磷脂酰胆碱组 8 3.48±0.45

胆宁片对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠血脂的影响：与正常组比较，模型组TG、TC、LDL均显著升高，HDL显著降低；与模型组比较，各治疗组TG、TC、LDL均下降，HDL升高，见表2。

表3 各组大鼠肝组织SOD和MDA的比较(±s)

表3 各组大鼠肝组织SOD和MDA的比较(±s)

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，⋆⋆P＜0.01，⋆P＜0.05；与多烯磷脂酰胆碱组比较，△△P＜0.01；与绞股蓝组比较，△△P＜0.01。

组别 动物数 SOD(U/mgprot) MDA(nmol/mgprot)正常组 8 49.55±4.30 1.04±0.10模型组 8 34.17±3.73## 1.30±0.07##胆宁片组 8 46.24±3.76⋆⋆△△ 0.96±0.06⋆⋆绞股蓝组 8 32.75±5.80 1.13±0.06多烯磷脂酰胆碱组 8 39.17±4.11⋆ 0.94±0.13⋆⋆

胆宁片对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠SOD和MDA的影响：与正常组比较，模型组大鼠肝组织中SOD明显降低(P＜0.01)、MDA明显升高(P＜0.01)；各治疗组药物均可改善肝组织中SOD和MDA含量，与模型组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表2 各组大鼠血清TG、TC、HDL、LDL的变化(±s，mmol/L)

表2 各组大鼠血清TG、TC、HDL、LDL的变化(±s，mmol/L)

注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，⋆⋆P＜0.01，⋆P＜0.05。

组别 动物数 TG TC HDL LDL正常组 8 2.13±0.34 1.87±0.35 1.54±0.33 0.39±0.05模型组 8 3.38±0.32## 2.94±0.53## 1.03±0.16## 0.49±0.13##胆宁片组 8 1.88±0.23⋆⋆ 1.69±0.36⋆⋆ 1.45±0.17⋆⋆ 0.35±0.12⋆绞股蓝组 8 2.27±0.31⋆⋆ 1.79±0.92 1.48±0.12 0.30±0.03多烯磷脂酰胆碱组 8 1.94±0.35⋆⋆ 2.20±0.59 1.38±0.18 0.38±0.14

讨论

近些年来，随着生活水平的不断提高、疫苗接种率的逐年提高，人群中肝脏疾病谱也发生着变化。慢性病毒性肝炎呈逐年下降趋势，而非酒精性脂肪性肝病的发生率不断上升，不容易引起重视，部分患者会逐步发展成为肝硬化，因此该疾病的治疗日渐成为广泛关注的课题。临床上往往以护肝对症治疗为主，而脂质在肝脏过度堆积得不到有效缓解，使疾病容易反复发作。

研究报道的非酒精性脂肪肝的发病因素多，目前尚无统一认识，但二次打击学说得到大家公认。目前大多数人认同NAFLD发病机制的“二次打击”学说[5]。“初次打击”主要是胰岛素抵抗(IR)，通过促使外周脂肪分解增加和高胰岛素血症，引起肝细胞脂肪储积，从而导致其对损害因子的敏感性增高；“二次打击”主要是氧应激、脂质过氧化、线粒体解偶联蛋白表达增加、细胞因子及Fas配体被诱导活化，从而引起炎症和纤维化。“二次打击”学说强调了NAFLD发病机制中线粒体、氧应激、脂质过氧化及细胞防御机制改变的作用及其相互关联的关系。其中氧应激(OS)是指体内氧化与抗氧化作用失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧自由基攻击细胞膜而引发疾病[6]。MDA是脂质过氧化反应的最终产物，过多的MDA会使体内SOD的活力下降，导致机体清除氧自由基的能力进一步下降，加重机体组织、细胞的损伤。因此，测定MDA和SOD水平常可以反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映肝细胞受损的程度。本实验结果显示，经高脂饮食诱导的NAFLD大鼠MDA活力明显升高，SOD活力明显降低，说明了肝细胞受损严重。

实验中，胆宁片治疗后肝指数与模型组比较(P＜0.01)，提示能够有效改善肝组织中脂质过度堆积的情况，从而在根本上解决脂质过氧化的问题。本实验结果表明，经高脂饮食诱导的NAFLD大鼠在予以胆宁片灌胃治疗后，肝组织形态学明显改善，肝细胞基本趋向正常。与模型组比较，血液中总胆固醇、甘油三酯含量明显下降(P＜0.01)，高密度脂蛋白含量明显升高(P＜0.01)；组织中SOD含量显著升高(P＜0.01)，而MDA含量则显著降低(P＜0.01)。肝组织中的MDA含量明显降低而SOD明显升高，提示胆宁片可能通过对体内SOD活性的影响，作用于氧自由基的产生或清除，在提高SOD方面明显优于多烯磷脂酰胆碱组。

综上所述，胆宁片在治疗NAFLD时，对肝组织中SOD和MDA的含量均有一定影响，通过对机体氧自由基的产生及清除重新达到平衡，起到了对肝脏的保护作用。此外，能够通过有效降低血脂的方式，从根本上解决脂质氧化、氧自由基产生过多的问题。临床上选择胆宁片治疗NAFLD是可行的。

[1]中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南[J].中华肝脏病杂志,2006,14(3):161-163.

[2]Browning J,Szczepaniak L,Dobbins R,et al. Prevalence of hepatic steatosis in an urban population in the United States:impact of ethnici[J].Hepatology,2004,40(6): 1387-1395.

[3]朱培庭,张静喆,高炬,等.“胆病从肝论治”理论与应用研究[J].中华中医药杂志, 2004,19(1):58-60.

[4]江庆澜,徐邦牢,杨辉,等.多烯磷脂酰胆碱对非酒精性脂肪肝大鼠的干预效果[J].广州医学院学报,2005,33(4):4-6.

[5]Day CP,James OF.Steatohepatitis:a tale of two“hit”？[J].Gastroenterology,1998,114: 842-845.

[6]Gonzales R,Auclair C,Voisin E,et al.Superoxide dismutase,catalase,and glutathione peroidase in red blood cells from patients with malignant diseases[J].Cancer Res,1984, 44(9):4137-4139.

Effect of Dan Ning tablet on SOD and MDA in rats with nonalcoholic fatty liver induced by high fat diet

Jiang Na,Zhang Jinhua,Wang Xiangning,Liu Zhiping,Xu Ying
Wuhan City Hankou Hospital of Hubei Province 430010

Research project Wuhan City Clinical Medicine Research Project:WX14C55

Objective:To explore the effect of Dan Ning tablet on SOD and MDA in rats with nonalcoholic fatty liver induced by high fat diet.Methods:53 SD rats were randomly divided into two groups:the normal group with 10 rats and the model group with 43 rats.The nonalcoholic fatty liver rat model was induced by high fat diet.From second weeks after modeling,one rat in the model group was randomly killed to observe the modeling situation for every other 1 weeks.The model was successfully established after 4 weeks,and 10 rats in the normal group were killed.The remaining 40 rats in the model group were randomly divided into 4 groups:the model group,the Dan Ning tablet group,the gynostemma group,the polyene phosphatidylcholine group.The each groups were given corresponding doses of drug gavage treatment.After 4 weeks of continuous administration,the rats were killed,and the serum triglyceride(TG),total cholesterol(TC),high density lipoprotein(HDL),low density lipoprotein(LDL)were detected by biochemistry method.The malonaldehyde(MDA),superoxide dismutase(SOD)content in the liver tissue homogenate were detected by colorimetry.Results:After the end of treatment,compared with the model group,the Dan Ning tablet group could effectively improve liver pathological state of rats(P＜0.05).Compared with the model group,the serum lipid in rat serum of the Dan Ning tablet group had different degrees of decline(P＜0.01,P＜0.05).The liver tissue MDA content of the Dan Ning tablet group was decreased(P＜0.01),and the SOD content was increased(P＜0.01),in which the increase SOD was better than that of the polyenephosphatidylcholine group and the gynostemma group(P＜0.01).Conclusion:Dan Ning tablets have protective effects on the improvement of NAFLD rats induced by high fat diet.

Nonalcoholic fatty liver;Rat;Dan Ning tablets;Superoxide dismutase;Malonaldehyde

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.2.1

科研项目武汉市临床医学科研项目：WX14C55