周学亮，方义湖，赵 勇，邹 斌，徐 华，刘季春

(南昌大学第一附属医院心脏大血管外科，江西南昌 330006)

大鼠Hes1腺病毒表达载体构建及功能鉴定*

周学亮，方义湖#，赵 勇，邹 斌，徐 华，刘季春△

(南昌大学第一附属医院心脏大血管外科，江西南昌 330006)

目的 构建高滴度大鼠Hes1腺病毒过表达载体(Ad-Hes1)。方法 以大鼠cDNA文库为模板，PCR法扩增Hes1，通过定向克隆构建pShuttle-CMV-Hes1穿梭质粒，再以pShuttle-CMV-Hes1为基础，构建pAdeno-Hes1病毒质粒，将pAdeno-Hes1转染293细胞，包装Ad-Hes1，利用改进TCID50法进行病毒滴度测定。Ad-Hes1感染H9c2心肌细胞，Western blot检测Hes1表达。结果 pShuttle-CMV-Hes1穿梭质粒、pAdeno-Hes1病毒质粒构建成功，总滴度为1.6×1011PFU，Ad-Hes1可在H9c2心肌细胞内正常表达，其MOI值为30。结论 Ad-Hes1包装成功，为进一步研究Hes1的心肌保护作用奠定实验基础。

腺病毒科；肌细胞,心脏；Hes1；质粒构建；病毒包装

Hes是果蝇hairy/E(spl)基因家族同系物，作为Notch1信号通路重要靶基因，其通过编码抑制型碱性螺旋-环-螺旋 (basic Helix-Loop-Helix,bHLH)，在调节多种细胞分化、增殖的Notch信号途径中起关键作用[1-3]，并影响细胞决定、发育、分化、增殖、凋亡、黏附及上皮-间质细胞转化[4-5]。研究发现，Hes可与Stat3形成Hes1-Stat3复合物，促进Stat3磷酸化和HIF-1α激活，进而发挥保护作用[6-7]。本研究发现，Hes1可作为介导分子，激活SAFE信号通路，发挥心肌作用[8]。因此本文将构建包装高滴度Hes1腺病毒病毒过表达载体(Ad-Hes1)，为进一步探讨Hes1心肌保护中的分子机制奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞及菌株 293细胞购自中科院上海生命科学院细胞库，DH5α超级化学感受态细胞购自汉恒生物科技有限公司。

1.1.2 大鼠cDNA文库及腺病毒载体系统 大鼠cDNA文库购自TaKaRa公司；pShuttle-CMV重组穿梭质粒、pAdeno质粒购自汉恒生物科技有限公司。

1.1.3 主要试剂 限制性内切酶(SfiⅠ,I-CeuⅠ,I-SceⅠ,XhoⅠ,PacⅠ)、Phusion超保真DNA聚合酶购自New England Biolabs公司，T4 DNA ligase购自Fermentas公司，CIP酶购自Promega公司，dNTPs购自上海生工生物工程技术服务有限公司，质粒小/中量提取纯化试剂盒、DNA纯化试剂盒、DNA凝胶回收与纯化试剂盒购自威格拉斯生物技术有限公司，LipofiterTM购自汉恒生物科技有限公司，细胞裂解液购自碧云天生物技术研究所，Mouse monoclonal to Hes1购自Abcam公司，β-Actin Mouse Monoclonal Antibody 购自Anbo公司，HRP affinipure goat anti-rabbit IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，增强化学发光底物购自Pierce Biotechnology公司。

1.1.4 引物设计与合成 根据GenBank中的大鼠Hes1基因编码序列(NCBI Reference Sequence:NM_024360.3)，Primer Premier 5.0设计Hes1克隆引物并插入SfiⅠ酶切位点(Forward Primer:5′-AAA AGG CCG CTG CGG CCA CCA TGA AGC GAC GAT GGA-3′,Reverse Primer:5′-AAA AGG CCT GTT TGG CCT CAG TTC CGC CAC GGC CT-3′)，产物大小为1 200 bp，由上海桑尼生物技术有限公司合成，规格为2A。

1.2 方法

1.2.1 pShuttle-CMV-Hes1重组穿梭质粒构建及鉴定 以大鼠cDNA文库为模板，PCR法获得Hes1片段，SfiⅠ酶切pShuttle-CMV重组穿梭载体及Hes1片段。CIP去磷酸化处理，T4 DNA Ligase连接过夜，转化DH5α化学感受态细胞，接种于含卡那霉素(Kan+)LB 平板培养皿。次日随机挑选阳性单克隆菌落，于Kan+LB液态培养基摇菌过夜，隔日小提质粒，行SfiⅠ酶切鉴定，再送上海桑尼生物技术有限公司基因测序。无突变的克隆命名为pShuttle-CMV-Hes1重组穿梭质粒。

1.2.2 pAdeno-Hes1病毒质粒构建 I-CeuⅠ、I-SceⅠ双酶切pAdeno载体、pShuttle-CMV-Hes1重组穿梭质粒，CIP去磷酸化处理，T4 DNA Ligase连接过夜，转化DH5α化学感受态细胞，接种含氨苄西林(Amp+)LB平板培养皿。次日随机挑选阳性单克隆菌落，于Amp+LB液态培养基摇菌过夜。隔日小提质粒，行XhoⅠ酶切鉴定，再送上海桑尼生物技术有限公司基因测序，无突变的克隆命名为pAdeno-Hes1病毒质粒。

1.2.3 Ad-Hes1包装、收毒、扩增及滴度测定 pAdeno-Hes1病毒质粒PacI 限制性内切酶线性化，转染293细胞，6 h后更换新鲜细胞培养液，出毒完毕后收集所有细胞及培养液，于-80 ℃和37 ℃间冻融3次，3 000 r/min离心5 min，上清液即为Ad-Hes1第一代毒种(P1)，作为毒种-80 ℃保存。取P1代毒种感染293细胞，待所有细胞脱落底面开始收毒，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入1 mL ST buffer(培养液+10%血清+2.5%甘油)，Votex混匀，于-80 ℃和37 ℃间冻融3次，3 000 r/min离心5 min，取上清液(P2)-80 ℃保存。依前法利用P2代病毒大量扩增病毒，纯化后利用改良TCID50法行病毒滴度测定。

1.2.4 Ad-Hes1功能鉴定 H9c2细胞传代107至6孔板，每孔分别加入约Ad-GFP、10 μL和30 μL(MOI约30和90)的Ad-Hes1腺病毒，4 h更换培养液，36 h后收集细胞蛋白，Western blot检测Hes1表达。

2 结 果

2.1 pShuttle-Hes1重组穿梭质粒成功构建 Hes1经PCR扩增后，经SfiⅠ酶切插入pShuttle-CMV重组穿梭质粒，获得pShuttle-Hes1转化子，SfiⅠ酶切后行1%琼脂糖凝胶电泳，获得1 200、3 400 bp两条带(图1A)，与预计结果相符。DNAMAN(Version 6.0.3.99)比对分析基因测序结果，与大鼠Hes1基因编码序列完全一致(图1B)。

A:pShuttle-Hesl酶切鉴定；B:pShuttle-Hesl。

图1 pShuttle-CMV-Hesl重组穿梭质粒构建及鉴定

2.2 pAdeno-Hes1病毒质粒构建 pShuttle-Hes1经I-CeuⅠ、I-SceⅠ双酶切，插入pAdeno载体获得pAdeno-Hes1转化子，XhoI酶切后行1%琼脂糖凝胶电泳，获得14.50、11.70、2.66、2.47、1.45、1.10、0.90、0.60 bp 8条带(图2)，与预计结果相符。

图2 pAdeno-Hesl病毒质粒酶切鉴定

2.3 Ad-Hes1包装、收毒、扩增及滴度测定 pAdeno-Hes1病毒质粒转染293细胞后，每天观察细胞出毒迹象，出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑，待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒(图3)。利用改进TCID50法测定Ad-Hes1滴度，结果为1.6×1011PFU/mL，体积1 mL，总滴度为1.6×1011PFU。

A：出毒初期；Bp:出毒后期。

图3 Ad-Hesl细胞出毒情况(×40)

2.4 Ad-Hes1功能鉴定 Ad-Hes1转染H9c2心肌细胞，48 h后提总蛋白，Western blot显示Hes1在Ad-Hes1组表达，病毒转染量越大，表达量越大，提示Ad-Hes1构建成功，可在H9c2细胞内正常表达(图4)。

图4 Ad-Hesl在H9c2心肌细胞内表达

3 讨 论

研究表明Hes基因家族包含Hes1-7，编码bHLH发挥转录抑制作用，在细胞分化、细胞周期停滞、细胞凋亡及细胞自我更新等多个生理过程中发挥关键作用[5,9]。Hes1蛋白包含bHLH、orange、WRPW保守结构域，bHLH包括与DNA结合的基本区域和螺旋-环-螺旋区域，其脯氨酸残基使Hes与DNA相结合，促进HLH形成二聚体。Orange为双亲性螺旋，位于bHLH结构域下游，维持bHLH相互作用的特异性。WRPW位于肽链羧基端，与共抑制子TLE/Grg形成复合物后，再与DNA的N-盒结合，从而改变了染色体的结构，使DNA的转录停止[10-11]。研究表明Hes1在心血管系统发挥重要作用，并发现Hes1在心脏前体细胞中表达，为心室流出道发育所必需[12]；笔者前期研究也表明心肌缺血后适应可激活Hes1，从而提高细胞存活率，减少活性氧(ROS)形成，稳定线粒体膜电位，抑制线粒体通透性转换孔开放，最终抑制心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用[13]。为深入研究Hes1在心肌保护中的分子机制，利用基因异位表达技术，针对Hes1构建病毒表达载体，可望在心肌细胞中特异性激活Hes1，从中观察Hes1的心肌保护效应。

目前，用于目的基因转移的病毒载体主要包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒载体[14]。重组腺病毒载体系统是研究基因转染最理想的载体系统，介导的基因转染效率高，适合用于绝大多数细胞和组织的转基因表达研究；同时可以产生高滴度病毒，也可用于基因治疗。重组腺病毒系统是E1和E3区缺陷的腺病毒载体系统，可重组高达10 000 bp的外源基因片段，免疫原性低，不引起宿主基因突变；并在同一载体上可克隆多个基因片段且能长效表达，产生的高滴度病毒既能感染分裂相细胞，又能感染未分裂相细胞，因此宿主范围广，应用广泛[15]。居于以上特点，考虑到由于Hes1片段较大，涉及细胞及动物实验，对病毒感染效率要求高，因此采用腺病毒载体系统构建Hes1过表达载体。

本研究应用腺病毒载体系统先构建pShuttle-CMV-Hes1重组穿梭质粒，再以pShuttle-CMV-Hes1为骨架，构建pAdeno-Hes1病毒质粒，然后感染至293细胞中进行病毒包装，细胞出毒后收集第一代(P1)毒液，并以此为毒种进行第二代(P2)出毒及大量病毒扩增。病毒滴度测定后，再感染H9c2心肌细胞，以确定Ad-Hes1构建成功，并可在心肌细胞里正常表达。笔者前期研究发现Notch1信号通路有明显的心肌保护效应[8]，Hes1作为Notch1信号的靶基因，是否在其中发挥重要作用需要进一步研究论证，而Ad-Hes1的成功构建，正为进一步研究Hes1的心肌保护作用奠定实验基础。

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Construction and functional identification of rat Hes1 adenovirus expression vector*

ZhouXueliang,FangYihu#,ZhaoYong,ZouBin,XuHua,LiuJichun△

(DepartmentofCardiovascularSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective to construct the high titers rat Hes1 adenovirus expression vector (Ad-Hes1).Methods With the rat cDNA as a template,the Hes1 fragment was amplified by PCR,which constructed pShuttle-CMV-Hes1 shuttle plasmid by directly clone.Based on pShuttle-CMV-Hes1,pAdeno-Hes1 virus plasmid was constructed.pAdeno-Hes1 was transfected into 293 cells to package Ad-Hes1,virus titers were determined by modified TCID50.Hes1 was detected by Western blot after Ad-Hes1 infected with H9c2 myocardial cells.Results pShuttle-CMV-Hes1 shuttle plasmid and pAdeno-Hes1 plasmid were constructed successfully,with a general titer of 1.6×1011PFU,Ad-Hes1 can be expressed in H9c2 myocardial cells,and its MOI value was 30.Conclusion Ad-Hes1 is successfully constructed and packaged,thus provide basis for further research on the protection effect of Hes1 on myocardium.

adenoviridae;myocytes,cardiac;Hes1;plasmid construction;virus packaging

��·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.05.003

国家自然科学基金资助项目(81570262)；赣鄱555领军人才计划(赣组字[2013]58号)；江西省自然科学基金重大项目(20152ACB20026)。 作者简介：周学亮(1980-)，副主任医师，博士，主要从事心肌疾病的信号通路研究。#共同第一作者：方义湖(1971-)，教授，硕士，主要从事心血管疾病基础研究。△

，E-mail:liujichun999@163.com。

R511.8

A

1671-8348(2017)05-0583-03

2016-07-18

2016-09-16)