郑鹏斌　万晨光　冯学泉++马景鑑　陈立　唐缨　牛宁宁　史源

【摘要】 目的：探讨“渐进式”颅内加压法诱导猪脑死亡对血清中ET-1、TNF-α、IL-1β及IL-6表达的影响。方法：雄性长白猪12头，随机分为两组，对照组：颅内置入颅内压探头及水囊导管，但不进行颅内加压；脑死亡组：颅内置入颅内压探头及水囊导管，根据颅内压和平均动脉压的关系，调整加压强度建立脑死亡模型，并通过呼吸、循环维持脑死亡状态12 h，并检测血清ET-1、TNF-α、IL-1β及IL-6水平。结果：脑死亡组ET-1水平从脑死亡0 h即逐渐升高，TNF-α、IL-1β、IL-6从脑死亡后6 h开始升高，上述因子水平与对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：脑死亡时TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子升高相对迟缓，而ET-1水平发生变化较早，灵敏度高，这可能与其作为前炎症介质有关。

【关键词】 脑死亡； 炎症因子； 内皮素-1

Preliminary Study of Effect of Brain Death on Serum ET-1，TNF-α，IL-1β and IL-6 Expression in Pigs/ZHENG Peng-bin，WAN Chen-guang，FENG Xue-quan，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（35）：006-010

【Abstract】 Objective：To investigate the influence of brain dead induced by “progressive” intracranial compression on the expression of ET-1，TNF-α，IL-1βand IL-6 in serum.Method：Twelve male Landraces were randomly assigned into two groups，the control group：intracranial pressure probe and a fogarty catheter were placed intracranially，but without compression.And the brain-dead group：intracranial pressure probe and a fogarty catheter were placed intracranially，according to the relationship between intracranial pressure and mean arterial pressure，adjust the intensity of intracranial compression to establish the brain death model，and through the respiration and circulation to maintain brain death status 12 h.The serum levels of ET-1，TNF-α，IL-1β，IL-6 were detected by radioimmunological analyzer.Result：The serum level of ET-1 in the brain death group was gradually increased from the beginning of brain death，TNF-α，IL-1β，IL-6 increased from 6 h after brain death，and the above factors were significantly different compared with those in the control group（P<0.05）.Conclusion：The results of this experiment show that in brain death TNF-α，IL-1β，IL-6 and other cytokines increased relatively slow，but ET-1 levels changes earlier with high sensitivity，which may be related to as proinflammatory mediators.

【Key words】 Brain death； Inflammatory factor； ET-1

First-authors address：The First Central Clinical College of Tianjin Medical University，Tianjin 300192，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.35.002

腦死亡是一个极其复杂的病理生理过程，且涉及多系统、器官。在分子水平探求该过程中某些因子的变化，有助于揭示脑死亡的分子病理机制，无论对重型颅脑损伤的救治还是脑死亡器官移植供体的保护，均具有重要的理论价值[1-2]。研究表明，脑死亡可激发机体发生急性非特异性炎症反应从而影响着各个器官的功能，即脑死亡状态下，细胞介质大量释放及免疫功能的过度激活是脑死亡从局部病变迅速发展为全身急性炎症反应综合征，进而引起多系统器官衰竭的重要机制[3-4]。本研究旨在初步探讨脑死亡对一些常见炎症因子表达的影响，为模拟临床常见脑损伤情况，本实验采取在实时颅内压监测下“渐进式”颅内加压法诱导猪脑死亡，并检测血清中炎症介质（包括ET-1、TNF-α、IL-1β、IL-6）的表达水平及其变化规律，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康清洁雄性长白猪12头，体重（39.6±5.2）kg。随机均分为两组，即对照组（A组）：颅内置入颅内压探头及水囊导管，但不进行颅内加压；脑死亡组（B组）：颅内置入颅内压探头及水囊导管，根据颅内压（ICP）和平均动脉压（MAP）的关系，调整颅内加压强度建立脑死亡模型，并通过呼吸、循环维持脑死亡状态12 h。

1.2 主要试剂及仪器 ET-1、TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA试剂盒，MP150 16通道生理信号记录分析仪，颅内压监护仪，颅内压监测探头，多功能呼吸麻醉机，Foley 14F水囊导管。

1.3 麻醉方法 术前禁食12 h，禁水6 h。麻醉开始前10 min臀大肌肌肉注射地西泮0.4 mg/kg、阿托品0.03 g/kg、盐酸胺碘酮15 g/kg行基础麻醉，猪仰卧位固定，行气管插管并连接多功能麻醉机（通气参数：潮气量9～13 mL/kg，吸氧浓度50%～90%，吸呼比1∶2，呼吸频率15～20次/min，以2%～3%浓度的七氟烷持续麻醉，并间断静注维库溴铵维持肌肉松弛。尾脱毛连氧饱和探头。

1.4 术中监测 麻醉满意后立即连接多功能监护仪监测心率（HR）和脉搏血氧饱和度。颈部手术暴露左侧颈外动脉及颈内静脉和右侧颈外静脉之后，分别穿刺置管，并且建立有创动脉压（IABP）、中心静脉压（CVP）检测及补液通路。膀胱造瘘置尿管接尿袋并固定。

1.5 模型建立 对Pratschke等[5]采用经典脑死亡模型进行改良，在实时颅内压监测条件下，建立稳定的猪脑死亡模型[6]。具体步骤如下：俯卧位固定猪，于双眼连线与矢状线交点后1 cm处行颅骨锥孔直径约2 cm，分离硬脑膜，Foley 14F水囊导管置于硬脑膜外并连接压力注射泵以备注水加压。于置水囊导管孔后2 cm左侧旁开1.5 cm处再行颅骨锥孔并置入Codman颅内压监测探头，外接ICP监护仪。于左右眶缘后2 cm处对称置入2支电极，参考电极固定在猪耳缘上并连接脑电图机，记录猪脑电（EEG）变化。然后以2.0 mL/min经Foley 14F水囊导管行颅内加压，直至ICP持续大于MAP，停止注水加压，60 min后停止所有麻醉维持药物，继续观察EEG并初步判定是否脑死亡。

1.6 脑死亡判定标准 参考《脑死亡判定标准与技术规范（成人质控版）》[7]拟定猪脑死亡判定标准如下：（1）深昏迷，排除麻醉、低温等导致的可逆性昏迷；（2）瞳孔对光反射、角膜反射均消失；（3）激发试验证实无自主呼吸，靠呼吸机维持通气；（4）脑电图呈静息电位。

1.7 脑死亡状态维持 根据血流动力学、出入量、血氧饱和度等变化给予对症处理，维持猪脑死亡状态生命体征接近临床脑死亡供体的要求[8-9]，即MAP>60 mm Hg，CVP 10～12 mm Hg，血氧饱和度≥95%，体温≥35 ℃。

1.8 观察指标 于颅内加压前（T1）、脑死亡0 h（T2）、脑死亡1 h（T3）、脑死亡3 h（T4）、脑死亡6 h（T5）、脑死亡后12 h（T6）6个时间点采血，静置离心后留取血清，置于-80 ℃保存待测。由广州瑞博生物科技有限公司检测各组样本血清中ET-1、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.9 統计学处理 采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组动物MAP与ICP变化 在整个实验过程中，A组动物MAP和ICP变化小，各时间点间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；颅内加压前，两组MAP比较，差异无统计学意义（P>0.05）；颅内加压过程中，B组因ICP增高出现Cushing反应，且MAP较A组明显增高，差异均有统计学意义（P<0.05）；脑死亡状态下，B组MAP虽然较A组有所降低，但两组比较差异无统学意义（P>0.05）。见表1和2。

2.2 两组血清ET-1、TNF-α、IL-1β、IL-6水平变化 在整个实验过程中，B组血清ET-1水平在脑死亡时开始升高，然而血清TNF-α、IL-1β、IL-6在脑死亡后6 h才开始升高，且上述介质水平与A组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；B组相邻时间点各炎症介质水平比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。A组血清各炎症介质水平变化差异小，各时间点间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表3～6。

3 讨论

目前，动物脑死亡模型建立方法很多（如硬脑膜外加压法、颅内制造血肿法、颈内动脉结扎法等），但应用最广泛的是颅内加压法建立的脑死亡模型，而颅内加压方式又分为爆发式[10]和渐进式[5]。爆发式脑死亡模型是指在极短时间内迅速加压直至脑死亡，该模型常常导致难治性低血压而使动物脑死亡状态无法长时间维持。而经典的Pratschke渐进式脑死亡模型是指根据血流动力学变化缓慢间断的进行颅内加压逐渐导致脑死亡。大量统计表明，临床脑死亡患者不管是脑血管意外还是重型颅脑损伤所导致的颅内持续高压通常不是在短时间内造成的，而是在较长的一段时间后逐渐形成的。因此，改良的缓慢间断颅内加压法与临床脑死亡的发生发展最为相似，而本研究是对Pratschke等采用的经典脑死亡模型进行改良[2]，在实时颅内压监测条件下，建立稳定的猪脑死亡模型，即在建立模型过程中，使颅内压不低于平均动脉压，导致脑血流量灌注严重不足，引起脑代谢障碍和脑脊液循环障碍，最终造成脑严重缺血缺氧及脑水肿而发生脑死亡。在颅内压增高过程中，脑组织因缺血缺氧等理化因素，刺激交感神经合成和分泌大量儿茶酚胺，进而引发“交感风暴”，出现血压增高、心率加快等现象，而后实验动物出现Cushing反应[11]（即血压升高、心跳减慢等），此时脑血流量自动调节功能已丧失[10，12]。笔者发现在实时颅内压监测状态下建立的脑死亡模型无论是在建立模型中还是脑死亡状态下的生命体征均较其他方法更加平稳，这可能与在实时颅内压监测条件下建立脑死亡模型时，根据颅内压和平均动脉压的变化调整颅内加压强度从而避免了因盲目加压所造成的颅内压大幅度波动有关。

脑死亡可促进细胞介质大量释放及免疫功能的过度激活，而发生急性非特异性炎症反应和免疫应答反应，导致脑死亡从局部病变迅速发展为全身炎症综合征，从而严重影响着脑死亡供体器官的功能及其移植的预后[2-3，13]。国外学者Skrabal等[1]在研究动物脑死亡与炎症介质的关系时，发现TNF-α、IL-1β、IL-6在血清中均明显升高，IL-1β、IL-6在心肺肾组织中均明显升高，然而TNF-α仅在肺组织中显著升高。Barklin[4]却发现TNF-α、IL-6、IL-10在脑死亡组心肝肾组织中的表达水平和对照组比较无明显差异。Amado等[14]在研究18例脑死亡患者血清炎症介质水平的变化规律时，发现TNF-α、IL-1β的表达水平无明显，而IL-6的表达水平却显著升高。孙振涛等[15]和朱长举[16]通过采用改良的缓慢间断颅内加压法建立脑死亡模型来研究猪脑死亡与炎症的关系时发现TNF-α、IL-1β、IL-6在血清中的表达水平自脑死亡后3 h就已经显著升高了，而笔者在研究探讨猪脑死亡与炎症介质的关系时，发现TNF-α、IL-1β、IL-6血清的表达水平自脑死亡后6 h才开始逐渐升高。这可能是因为在实时颅内压监测条件下建立脑死亡模型时，根据颅内压和平均动脉压的变化调整颅内加压强度，不仅避免了颅内压升高过快或过高所造成不必要的脑组织损伤，而且避免了因颅内压波动过度造成的血流动力学的大幅度波动有关，因为上述两者均可导致机体血流动力学紊乱，各个组织器官灌注不足等进而发生炎症反应。

除了TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症反应常见检测指标，笔者对最强的缩血管活性肽，内皮素-1（endothelin-1，ET-1），也进行了检测。ET-1是由21个氨基酸组成的，主要由内皮细胞合成和分泌，也广泛存在于各个脏器组织细胞内。近年来研究发现ET-1在炎症反应中发挥着不可取代的促炎作用。Foitzik等[17]和Paulino等[18]在动物实验研究中发现内皮素可介导小鼠体内的单核细胞、中性粒细胞及淋巴细胞等合成和分泌大量炎症介质，诱导全身炎症反应以及多器官功能衰竭。黄莹等[19]在重症急性胰腺炎SD大鼠模型中发现血清内皮素水平显著升高。李莉等[20]在研究脑死亡大鼠肝功能时发现血清ET-1在脑死亡时就开始升高，并随着脑死亡时间的延长而逐渐升高。笔者在研究探讨猪脑死亡血清ET-1水平的变化时，发现血清ET-1水平在判定脑死亡时就已经明显升高，而且较TNF-α、IL-1β、IL-6等典型炎症因子水平升高提前，这是因为在颅内压增高过程中，动物发生应激反应促进ET-1分泌，而ET-1又作为前炎症因子可诱导白细胞等合成和分泌炎症介质而激发急性非特异性炎症反应，同时这些炎症介质又可通过正反馈作用促进ET-1的合成和分泌以及诱导其他多种炎症介质的分泌，可见ET-1用于检测脑死亡所介导的炎症反应较其他炎症介质更灵敏。

综上所述，脑死亡时炎症反应及炎症因子表达与脑死亡过程的快、慢密切相关，本实验采取实时颅内压监测下“渐进式”颅内加压法建立的脑死亡模型不仅更加稳定，而且急性非特异性炎症反应发生相对迟缓且较轻。就本实验检测的指标而言，TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子升高相对迟缓，ET-1水平升高较早，灵敏度高，这可能与其作为前炎症介质有關。

参考文献

[1] Skrabal C A，Thompson L O，et al.Organ-speci?c regulation of pro-in?ammatory molecules in heart， lung， and kidney following brain death[J].J Surg Res，2005，123（1）：118-125.

[2] Watts R P，Thom O，Fraser J F.Inflammatory signalling associated with brain dead organ donation：from brain injury to brain stem death and posttransplant ischaemia reperfusion injury[J].J Transplant，2013，2013：521 369.

[3] Aur?en H，Mollnes T E，Bj?rtuft ?，et al.Multiorgan procurement increases systemic inflammation in brain dead donors[J].Clin Transplant，2013，27（4）：613-618.

[4] Barklin A.Systemic inflammation in the brain-dead organ donor[J].Acta Anaesthesiol Scand，2009，53（4）：425-435.

[5] Pratschke J，Wilhelm M J，Kusaka M，et al.A model of gradual onset brain death for transplant-associated studies in rats[J].Transplantation，2000，69（3）：427-430.

[6]万晨光，冯学泉，李牧，等.改良猪脑死亡模型的建立[J].天津医药，2014，42（4）：318-320.

[7]国家卫生和计划生育委员会脑损伤质控评价中心.脑死亡判定标准与技术规范（成人质控版）[J].中华神经科杂志，2013，46（9）：637-440.

[8]张天锡.对“脑死亡”诊断标准的认识[J].中华神经外科疾病研究杂志，2003，2（2）：97-99.

[9] Blaine E M，Tallman R D Jr，Frolicher D，et al.

V asopressin supplementation in a porcine model of brain-dead potential organ donors[J].Transplantation，1984，38（5）：459-464.

[10] Takada M，Nadeau K C，Hancock W W，et al.Effects of explosive brain death on cytokine activation of peripheral organs in the rat[J].Transplantation，1998，65（12）：1533-1542.

[11] Cushing H.Some experimental and dinical observations concerning states of increased intracranial tension[J].Am J Med Sci，1902，124（3）：373-379.

[12]谷振勇，李如波，姜景涛，等.应用颅内高压复制脑死亡动物模型[J].河北医科大学学报，1999，20（6）：341-343.

[13] Floerchinger B，Oberhuber R，Tullius S G.Effects of brain death on organ quality and transplant outcome[J].Transplant Rev（Orlando），2012，26（2）：54-59.

[14] Amado J A，Loper-Espadas F，Vazquez-Barquero A，et al.

Blood levels of cytokines in brain-dead patients： relationship with circulating hormones and acute-phase reactants[J].Metabolism，1995， 44（6）：812-816.

[15]孫振涛，韩雪萍，苗丽君，等.琥珀酰明胶容量治疗对脑死亡后血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影响[J].医学与哲学，2008，29（22）：62-64，66.

[16]朱长举.脑死亡猪肝脏免疫性损伤机制及损伤防护的实验研究[D].郑州：郑州大学，2007.

[17] Foitzik T，Faulhaber J，Hotz H G，et al.Endothelin mediates local and systemic disease sequelae in severe experimental pancreatitis[J].Pancreas，2001，22（3）：248-254.

[18] Paulino E C，de Souza L J，Molan N A，et al.Neutrophils from acute pancreatitis patient cause more severe in vitro endotholial damage compared with neutrophils from healthy donors and are differently regulated by endothelins[J].Pancreas，2007，28（1）：37-41.

[19]黄莹，谭超超.内皮素受体阻断对重症胰腺炎病情及炎症反应的影响[J].广东医学，2015，36（9）：1327-1331.

[20]李莉，陈政，欧阳文.前列地尔对脑死亡大鼠肝脏功能的保护及血清TNF-α和内皮素-1表达的影响[J].中南大学学报，2010，35（12）：1272-1277.

（收稿日期：2016-11-16） （本文编辑：程旭然）