张鸿晖　刘先发

【摘要】 目的：研究在肝細胞癌中STAT3下调后，caspase3、muc1及cyclinD1表达量的变化，筛选出针对肝癌STAT3信号通路的关键分子。方法：选择2014年5月-2016年5月，40例来本院进行治疗的肝癌患者为研究对象，分别取肝癌组织和癌旁正常组织为研究材料。进行免疫荧光、Western blot分析肿瘤组织和细胞中STAT3及P-STAT3蛋白的表达。根据GENEBANK上提供的STAT3编码序列，筛选目标序列，取相同目标序列为潜在siRNA靶位点，BLAST比对后设计多个靶序列siRNA，以荧光素标记，体外转染细胞株，筛选转染效率最佳siRNA序列。用RT-qPCR技术分析人肝癌细胞株中caspase3、muc1、cyclinD1、P21、MMP2 mRNA的表达量，Western blot分析转染后细胞株中STAT及P-STAT3蛋白的表达。结果：通过Western blot检测肝癌组织和癌旁正常组织中STAT3和P-STAT3蛋白的表达量发现，肝癌组织中的STAT3和P-STAT3蛋白的表达量比癌旁正常组织中的表达量高；下调STAT3可以抑制肝癌细胞Hep-G2的增殖和体外侵袭能力，促进细胞凋亡，沉默STAT3基因，其STAT3信号通路上的信号分子也在不同时间点显著性下调表达。结论：由此可见阻断或下调STAT3信号通路可以抑制肝癌细胞増殖及侵袭生物学行为影响，STAT3有可能是肝脏肿瘤治疗新的优良分子靶点。

【关键词】 肝癌； STAT3； 信号分子

Effect on the Expression of Caspase3，Muc1 and CyclinD1-A Mechanism Research after STAT3 Downregulation in Hepatocellular Carcinoma/ZHANG Hong-hui，LIU Xian-fa.//Medical Innovation of China，2016，13（35）：011-015

【Abstract】 Objective：To screen out key molecular for hepatocellular carcinoma（HCC） STAT3 signaling pathways and to study the expression quantity change of caspase3，muc1 and cyclinD1 in HCC after the STAT3 downregulated.Method：From May 2014 to May 2016， 40 liver cancerpatients of our hospital for treatment were as the research objects，and liver cancer tissue and normal adjacenttissue to carcinoma taken respectively from these people were as the research material.The techniques of immunofluorescence and Western blot were used to analyze the expression of STAT and P-STAT3 proteinin tumor tissues and cells.According to the GENEBANK of coding sequence of STAT3，and screening out target sequence，the same target sequences were taken as potential siRNA targeted point.Multiple target sequences of siRNA were designed after the BLAST comparison，modifiedwith fluorescein markers，then transfected in cell lines，to screen out transfection most efficient siRNA sequences.Using RT-PCR technique analyzing the mRNA level on expression quantity of caspase3，muc1，cyclinD1，P21 and MMP2 in human liver cell lines.Western blot was used to analyze the expression of the STAT and P-STAT3 protein after transfection cell lines.Result：We found that STAT3 and P-STAT3 protein expression content in cancer of the liver tissue was higher than that in normal tissue adjacent to carcinoma by Western blot to test the expression of STAT3 and P-STAT3 protein respectively in HCC tissue and normal tissue adjacent to carcinoma.Downregulation STAT3 could inhibit the Hep-G2 proliferation in liver cancer cell and invasion abilityin vitro，promoted apoptosis，and made STAT3 gene silence.STAT3 signal molecules on the signaling pathway also significantly lower expression at different time points.Conclusion：We find that STAT3 downregulation could inhibit the biological behaviour influence in the liver cancer cell proliferation and colonization.We speculate that STAT3 might be the new molecular targets of liver cancer in the treatment of HCC.

【Key words】 Liver cancer； STAT3； Signaling molecules

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou 341000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.35.003

我国是病毒性肝炎高发区，也是原发性肝细胞肝癌高发区，全世界每年新发肝癌病例的42.5%出现在我国大陆，近20年来我国原发性肝细胞肝癌患者的死亡率增加了41.17%，严重危害人民健康，影响社会生产力，因此寻找原发性肝细胞肝癌有效治疗方法意义重大[1]。随着医学生物学研究的不断深入，发现某些细胞信号通路的异常激活在肿瘤发生发展中至关重要，而核因子扮演重要角色，负责完成细胞外信号传递至核内，影响细胞生物学行为[2-3]。信号转录因子及活化子（STATS）是细胞内和受体相结合的蛋白，可以完成从胞质到核内的信号转导，当细胞受到刺激时，STATS上的SH3结构域与受体上被磷酸化的酪氨酸残基结合，同时自身被JAK磷酸化，STAT3可能是一种癌基因[4]。STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号通道汇聚的焦点，在多种肿瘤细胞和组织中都有激活， STAT3激活后诱导某些与细胞增殖、分化、凋亡密切相关的关键基因异常高表达， 通过各种途径促进细胞增殖、恶性转化、阻碍细胞凋亡， 表现出致癌的作用[5-8]。因此有关肿瘤中STAT3的信号通路近年成为研究热点，其很有可能成为肿瘤基因靶向治疗的优良分子靶点。本研究假设如果阻断STAT3蛋白表达，作为酶促反应的产物-磷酸化STAT3蛋白量也会相应下降，最终肝脏肿瘤的增殖侵袭能力会受到抑制，STAT3有可能是肝脏肿瘤治疗新的优良分子靶点。本研究的目的是初步证实以STAT3为靶分子阻断STAT3信号通路可以抑制肝癌细胞増殖侵袭，为下一步实验提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年5月-2016年5月，40例来本院进行治疗的肝癌患者为研究对象，分别取肝癌组织和癌旁正常组织为研究材料，40例患者中，男21例，女19例，年龄36～62岁，平均（47.46±3.02）岁。肝癌细胞株Smcc-7721，Hep-G2，MHCC97-H，人正常肝细胞株LO2，均来自本实验室保存。

1.2 组织切片和免疫荧光 （1）将湿纸巾铺于载玻片盒底部做成加湿盒，由冰冻切片仪中取出载有切片的载玻片，放入玻片盒中（每边放6片），或故湿盒中（载玻片勿相互接触）；（2）待载玻片达室湿且未干时，铺加PBS于切片上（勿溢出玻片）；（3）稀释的第一抗体于4 ℃用微量离心机以13 500 g离心

2 min，每一载玻片上加40～50 μL抗体，应能盖住切片；（4）用与泵相连的巴斯德吸管，在切片的一端吸去玻片上的PBS，并从另一端加上抗体，盖上加湿盒，室温温育1 h；（5）以PBS冼玻片

3次（5 min/次），从切片一端加入新的PBS缓冲液，由另一端吸去旧的缓冲液；（6）稀释的第二抗体于4 ℃用微量离心机以13 500 g离心2 min，每载玻片可加40～50 μL抗体；（7）将第二抗体加于切片上，置加湿盒中室温温育1 h，以PBS洗玻片3次（5 min/次）；（8）将盖玻片放于纸巾上，滴加1滴Gelvatol于盖玻片中央。翻过载玻片放于盖玻片上（勿施压），将玻片置工作台上，用铝箔覆盖避光放置30 min，使Gelvatol 凝结；（9）显微镜下观察结果，或置玻片盒中贮于4 ℃。

1.3 Western blot检测STAT及 P-STAT3蛋白含量 （1）裂解肝癌组织和癌旁正常组织，用蛋白质提取试剂盒提取总蛋白；（2）蛋白在沸水浴中加热3～5 min，使蛋白质充分变性，冷却室温，4 ℃保存待用；（3）配饰SDS-PAGE凝胶，将变性准备好的蛋白上样电泳，使不同大小的蛋白质分离；（4）转膜，将目的蛋白用硝酸纤维素膜进行水浴转膜；转膜完成后用Western洗涤液，漂洗1～2 min，洗去转膜液；（5）封闭，将洗涤液吸净后，加入封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭1 h；（6）抗体标记，根据一抗和二抗的说明书，先后进行一抗和二抗孵育，对蛋白进行抗体标记；（7）标记完成后，进行显影与图像分析。

1.4 筛选细胞株 （1）根据GENEBANK上提供STAT3序列，在网站上筛选目标序列。（2）取相同目标序列作为潜在的siRNA靶位点，经BLAST比对，排除其他编码序列/EST同源的序列，设计多个靶序列siRNA。（3）以荧光素标记，体外转染Smcc-7721，Hep-G2，MHCC97-H三种肝癌细胞株和正常肝细胞株LO2，筛选转染效率最佳siRNA序列。（4）收集24、48、72 h转染细胞系，提取RNA，逆转录为cDNA后，通过荧光定量PCR（RT-PCR）检测STAT3基因的表达量，筛选出反應最优的肝癌细胞株。一步法提取细胞总RNA；逆转录cDNA；PCR 扩增；PAGE分离cDNA产物，用凝胶图象分析系统处理

1.5 细胞培养和siRNA干扰 （1）37 ℃，5%CO2及饱和湿度下，培养筛选出来的反应最优的肝癌细胞株和正常肝细胞株LO2细胞。（2）转入24孔板，继续培养24 h，到对数生长期。（3）别用空白对照，脂质体转染试剂组，siRNA-STAT3，STAT3错配siRNA转染LO2和筛选出的肝癌细胞株。（4）转染24、48、72 h，收集细胞用MTT法检测肿瘤细胞的细胞增值率，加入MTT孵育3～4 h后，弃去各孔液体，加入200 μL DMSO震摇10 min，于550 nm处用酶标仪测定吸光值。（5）转染24、48、72 h，收集细胞用流式细胞术（FCM）分析细胞周期，用Annexin V-FITC/PI双标记检测细胞的凋亡率，收集的细胞用PBS漂洗后，按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书进行染色，然后采用流式细胞仪检测，并计算细胞的凋亡率。（6）用Transwell法检测肿瘤细胞的侵袭能力。首先将聚碳酸酯膜用Matrigel胶进行包被；调整细胞浓度为1×106/mL，在Transwell的上室中加入100 μL的细胞混悬液，在下室中加入600 μL含有10%小牛血清的DMEM培养基；细胞培养箱中孵育24 h，取出滤膜，用4%的多聚甲醛固定，胎盘兰染色；显微镜下计数穿透的滤膜下层的细胞数，随机选取8个视野求平均数。（7）转染24、48、72 h，收集细胞siRNA-STAT3转染LO2和筛选出的肝癌细胞株，提取RNA，逆转录为cDNA后，用RT-PCR分析 caspase3、muc1、cyclinD1基因的表达量变化

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。P<0.05为差异有统计学意义。用单因素变量方差分析法 （ANOVA）分析样品间基因表达量差异，利用 Dunnettt-Test（2-sided）进行多重比对。利用GraphPad.Prism.v5.0软件进行作图。

2 结果

2.1 STAT3和P-STAT3在肝癌组织和癌旁正常组织中的表达量 通过Western blot检测肝癌组织和癌旁正常组织正常中STAT3和P-STAT3蛋白的表达量发现，肝癌组织中的STAT3和P-STAT3蛋白的表达量比癌旁正常组织中的表达量高，见图1。

2.2 SiRNA-STAT3转染效率的检测 SiRNA-STAT3转染四种细胞Smcc-7721、Hep-G2、MHCC97-H、LO2的结果，见图2，其中肝癌细胞中Hep-G2细胞的转染效果最佳。

2.3 MTT法检测细胞增值率 细胞增值率用MTT法检测，siRNA-STAT3转染肝癌细胞株Hep-G2后24、48、72 h的细胞增殖率比同时间点其他组和空白对照组低，且与空白对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.4 Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞的凋亡率 细胞凋亡率用Annexin V-FITC/PI双标记法检测，siRNA-STAT3转染正常肝细胞LO2和肝癌细胞株Hep-G2后24、48、72 h的细胞增殖率均比同时间点空白对照组高，且差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.5 Transwell法检测肿瘤细胞的侵袭能力 用Transwell法检测肿瘤细胞的侵袭能力，细胞培养箱中孵育24 h，取出滤膜，用4%多聚甲醛固定，胎盘兰染色；在显微镜下计数穿透的滤膜下层的细胞数，随机选取8个视野求平均数。统计结果如下：空白对照LO2细胞（93.2±7.2）个，空白对照Hep-G2细胞（98.5±8.5）个，脂质体转染LO2细胞（94.4±8.2）个，siRNA-STAT3转染LO2细胞（83.4±5.7）个，STAT3错配siRNA转染LO2细胞（88.6±8.4）个，脂质体转染Hep-G2细胞（99.1±9.1）个，siRNA-STAT3转染Hep-G2细胞（38.5±6.2）个，STAT3错配siRNA转染Hep-G2细胞（95.7±9.12）个，由此可见siRNA-STAT3转染肝癌细胞株Hep-G2后24 h后穿膜细胞数目明显低于其他组和空白对照组，且与空白对照组相比差异具有显著性（P<0.05），因此可见沉默STAT3可以抑制肝癌细胞Hep-G2的体外侵袭能力。

2.6 RT-PCR检测caspase3、muc1及cyclinD1基因的表达量 用荧光定量PCR检测caspase3、muc1及cyclinD1基因的表达量结果，见图3。转染24、48、72 h后，caspase3、muc1及cyclinD1均有下调，且caspase3在24 h，muc1在72 h，cyclinD1在48 h时，下调差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

RNA干扰（RNAi）技术是近年来发展起来的一项新技术，设计一段微小的RNA分子，与需要干扰的基因的某个片段吻合，使之无法正常傳递遗传信息，使致病的基因“沉默”下来，RNAi的机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成22 bp大小的小干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）[9]，siRNAs可进一步掺入多部分核酸酶（multicomponent nuclease，RISC）并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达。哈佛医学院的研究人员首次用RNA干扰使活体动物的致病基因“沉默”[10]，已经成功地利用这种核糖核酸干扰技术治愈了实验鼠的肝炎，如果进一步证实这种技术在人体内有效，将为包括肝癌在内的众多疾病提供新疗法。而影响治疗效果的重要因素之一，RNA干扰靶基因的选择尤为重要，STAT3的激活对于细胞的生长与凋亡，以及细胞周期的调控都有着重要的影响，而STAT3自身又是EGFR、IL-6/JAK、Src等多个致癌性酪氨酸激酶信号通道汇聚的焦点，因此STAT3是肿瘤基因沉默靶向治疗的优良分子靶点[11-12]。

我国是原发性肝癌高发国，相对于欧美国家，我国原发性肝癌的流行病学特征，发病机理存在明显差异，肝癌患者往往伴有乙型肝炎病毒感染、肝硬化，肝脏细胞处于缺血缺氧微环境，同时由于长期肝炎病毒感染刺激，体内各类炎性反应因子长期处于高水平状态，其中包括gp130亚基受体家族配体的IL-6、IL-12等[13-14]。Cascio等[2]在研究结肠癌细胞系HT-29时发现STAT3可以上调细胞内瘦素表达，牛丽文等研究瘦素诱导的肝星状细胞Ⅰ型胶原基因的表达时提出，瘦素可以刺激定植在肝脏内的KUPPER细胞合成分泌IL-6，由此可以做出假设，在肝炎肝硬化背景下，细胞处于缺氧和病毒感染微环境下，使体内IL-6水平升高，进一步与肝脏肿瘤细胞表面的含有gp130亚基受体结合，在JAK2的作用下，使STAT3磷酸化处于激活状态，相应的下游分子表达发生变化[15-16]。同时细胞瘦素表达水平提高，刺激KUPPER细胞分泌IL-6，如此反复，使得肿瘤细胞内STAT3磷酸化水平不但升高而且持久，最终促进肝脏肿瘤细胞增殖、转移、免疫逃逸等演进行为[17-20]。

本研究结果显示，siRNA-STAT3转染肝癌细胞株Hep-G2后24、48、72 h后其下游分子caspase3、muc1及cyclinD1基因的表达量均在不同时间点显著性下调，由此可见，沉默STAT3蛋白，阻断了STAT3信号通路。细胞增殖率检测结果发现，检测时间点细胞增殖率都显著性低于同时间点的其他组和空白对照组，因此可见下调STAT3可以抑制肝癌细胞Hep-G2的增殖。同时细胞凋亡率结果可见，siRNA-STAT3转染正常肝细胞LO2和肝癌细胞株Hep-G2后24、48、72 h的细胞增殖率显著性高于同时间点的空白对照组，因此可见沉默STAT3促进正常肝细胞LO2和肝癌细胞Hep-G2的凋亡，并且细胞侵袭力也受到了抑制。由此可见阻断或下调STAT3信号通路可以抑制肝癌细胞増殖及侵袭生物学行为影响，STAT3有可能是肝脏肿瘤治疗新的优良分子靶点。

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（收稿日期：2016-11-14） （本文编辑：程旭然）