王 颖 张贝贝 阿地拉·艾皮热 张 冀 罗娇娇 张富春

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐830046)

电脉冲法增强CZP3 DNA疫苗免疫不育效果的研究①

王 颖 张贝贝 阿地拉·艾皮热 张 冀 罗娇娇 张富春

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，乌鲁木齐830046)

目的：研究电脉冲法对CZP3 DNA疫苗免疫不育效果的影响。方法：在小鼠腿部肌肉分别注射5、10、20和50 μg的pcDNA3.0-CZP3质粒，经电脉冲刺激，ELISA法检测免疫小鼠的CZP3抗体水平及最高抗体滴度。与雄鼠合笼三周后，计算各免疫组的不孕率及平均产仔数，统计学分析。结果：相比单独肌肉注射免疫，电脉冲法能极显著提高DNA疫苗的免疫水平,电脉冲50 μg组的抗体效价可以达到1∶4 000。此外随着血清中CZP3抗体水平的增高，小鼠不孕率明显上升，平均产仔数显著减少。统计分析显示，免疫小鼠的CZP3抗体水平与产仔数呈负相关关系。结论：电脉冲法能够显著提高CZP3 DNA疫苗的免疫水平，降低小鼠生育能力，这为CZP3 DNA疫苗应用于流浪犬避孕奠定了基础。

卵透明带3；DNA疫苗；电脉冲法；免疫不育

近年来，由于犬走失及饲养者将犬放归野外等原因的存在，使得我国流浪犬数量激增，如仅2012年乌鲁木齐市动物疾控中心公布的全市流浪犬的数量就高达7 000只，这不但引发了很多城市环境、卫生、管理等方面的问题，更增加了人畜共患传染病的传播机率，我国每年因狂犬病死亡的人数超过2 000人，在传染病中仅次于艾滋病的致死人数，如何控制流浪犬数量成为一个社会难题。目前控制流浪犬数量的方法有扑杀、去势、免疫避孕等方法。扑杀方法时效较短，物种专一性差，且违背动物福利，违反动物保护法；去势又因为费时费力，人工成本很高，难以有效推广；因此采用人道而又方便易行、直接有效的避孕疫苗控制流浪犬数量的方法得到了广泛的认可。

卵透明带(Zona pellucid,ZP)主要由3种糖蛋白(ZP1、ZP2、ZP3)组成，ZP3是精子的初级受体，诱发精子的顶体反应，其抗体可以阻止精卵结合[1]，已经有大量的实验证明动物免疫ZP3蛋白后产仔数显著下降[1-5]。目前针对犬ZP3(CZP3)避孕疫苗的研究主要以蛋白疫苗为主，如用CZP3与T细胞表位结合或精子蛋白Izumo结合制作成各种融合蛋白疫苗都取得了不错的免疫效果[6-8]。但已有研究表明，CZP3蛋白表达量低，纯化难度大，且纯化的蛋白保存条件要求高，因而表达成本很高，很难满足犬免疫避孕的市场需求。DNA疫苗具有制备工艺简便、生产成本低、表达的抗原生物活性高、可诱导机体产生细胞、体液等多种免疫应答形式的优点。DNA疫苗已在多种疫病中开展了广泛研究，其中乙肝DNA疫苗已进入临床阶段。DNA疫苗虽然有很多优点，但因其肌肉注射免疫后，进入抗原递呈细胞(APC)的量很少，递呈效率较低，导致其诱导的免疫应答水平不高，这限制了其进一步的应用。已有研究证实，电脉冲可以显著提高DNA疫苗转染效率，诱导产生较高的免疫应答[9-12]。研究者在猕猴、羊及猪等动物中使用过电脉冲方式进行DNA疫苗免疫，与传统注射方式相比，电脉冲注射明显提高了动物机体对疫苗的应答响应[13-16]。但目前电脉冲法应用于DNA避孕疫苗的研究鲜有报道。

本研究拟用电脉冲法辅助CZP3 DNA疫苗免疫小鼠，检验电脉冲法对于CZP3 DNA避孕疫苗的免疫增效效果和最佳免疫剂量，评估免疫避孕效果，分析抗体水平与抗生育能力的相关性，为CZP3 DNA避孕疫苗的进一步应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂 质粒pcDNA3.0为本实验保存，pcDNA3-CZP3为本实验室构建，6～8周龄BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。His标签一抗、HRP标记的山羊抗鼠二抗均购自北京全式金公司。其他化学试剂均为国产分析纯级。

1.2 实验方法

1.2.1 pcDNA-CZP3的制备 将pcDNA3-CZP3重组质粒氯化钙法转入DH5α中，铺板，挑取单克隆菌株，摇菌，提取质粒，酶切及测序鉴定。对鉴定正确的菌株扩增2 L菌液，按照《分子克隆3》的实验步骤，进行质粒的大量提取、纯化。用灭菌的生理盐水溶解质粒后，用Nanodrop测定质粒的浓度。调整质粒浓度，使注射组的质粒终浓度为0.5 μg/μl，电脉冲注射组的质粒终浓度分别为：0.25、0.5、1、2.5 μg/μl。pcDNA3.0空质粒作为阴性对照，其质粒制备及定量均按上述方法。

1.2.2 小鼠免疫实验 小鼠分组及免疫程序如表1，42只BALB/c小鼠随机分为7组，每组6只。于免疫前24 h小鼠腿部肌肉分多点注射5 μg普鲁卡因，选择性破坏肌肉纤维，使肌细胞再生，增强细胞对于质粒DNA的吸收。各电脉冲法免疫组在60 V电压下进行电脉冲刺激。免疫后每周对小鼠眼眶静脉丛采血，分离血清，-80℃冻存备用。

表1 小鼠实验分组及免疫程序

Tab.1 Mice experiment groups and immunization programs

ImmunecycleImmunegroups0d14d28dIMcontrol50μg50μg50μgIMCZP350μg50μg50μg50μgEPControl10μg10μg10μgEPCZP35μg5μg5μg5μgEPCZP310μg10μg10μg10μgEPCZP320μg20μg20μg20μgEPCZP350μg50μg50μg50μg

Note：IM.Intramuscular inject；EP.Electric pulse.

1.2.3 抗体水平检测 用本实验室构建的pET28a-CZP3c表达的CZP3c蛋白作为包被抗原，通过棋盘法确定包被浓度为10 μg/ml，100 μl包被96孔酶标板。一抗的稀释比例为1∶100，山羊抗鼠二抗的稀释比例为1∶2 000，OD450检测抗体水平。

1.2.4 pcDNA-CZP3免疫组抗体效价检测 用电脉冲免疫pcDNA-CZP3 50 μg组小鼠第6周的血清做倍比稀释，稀释倍数分别为1∶50、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000，ELISA检测抗体滴度。

1.2.5 抗生育水平检测 初免后42 d，将具有生育能力的BALB/c雄鼠按照1∶3的比例与免疫过的雌鼠进行合笼，每天轮换雄鼠。3周后将雄鼠取出，统计雌鼠的产仔数，计算不育率。

2 结果

2.1 pcDNA3-CZP3的制备 EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定结果显示，在约1 200 bp处出现目的条带(图1)。测序结果与Genbank上公布的CZP3基因的序列同源性100%。

2.2 CZP3抗体水平检测 初免后2周，不同电脉冲法免疫剂量组的小鼠都产生了针对CZP3的抗体，而注射组与其对照组相比没有出现差异，直到初免后4周注射组才产生抗CZP3抗体。到初免后6周注射组和电脉冲各免疫剂量组的抗体水平达到峰值，随后开始下降，到初免后24周，注射组和各电脉冲法剂量组的抗CZP3抗体仍然维持在一定的水平。注射组与注射对照组相比只有初免后第9周才出现极显著差异，而电脉冲各剂量组从初免第4周开始一直到第24周与对照组相比都呈显著差异，初免后第6～14周呈极显著差异，其中50 μg电脉冲法免疫组的抗体水平自第6周后一直处于各免疫组的最高水平。比较50 μg注射组和50 μg电脉冲组免疫水平发现，从初免后第2周到24周50 μg电脉冲组与50 μg注射组的抗体水平呈显著差异，其中第4～24周呈极显著差异。见图2。

2.3 50 μg pcDNA3-CZP3电脉冲组抗体效价检测 将50 μg pcDNA3-CZP3电脉冲法免疫组小鼠第6周的血清分别进行倍比稀释后，ELISA检测最高抗体效价。图3显示，抗体稀释1∶4 000时，电脉冲免>疫组小鼠的抗体水平相对于空白对照组呈极显著差异。

图1 pcDNA-CZP3双酶切鉴定Fig.1 Identification of pcDNA3-CZP3 digested by EcoRⅠ and XhoⅠNote: 1.pcDNA3-CZP3 digested by EcoRⅠ and XhoⅠ; M.DL 2 000 marker.

图2 不同免疫组的小鼠CZP3抗体水平检测Fig.2 Antibody level of BALB/c mouse from different groups detected by ELISANote: A.Antibody level of injection group;B.Antibody level of electroporation group;C.Antibody level at same immune dose group(*.vs control group，0.01

表2 小鼠抗生育免疫实验结果统计分析

Tab.2 Analysis of mice immune experiment statistical result

ImmunegroupMicenumberPregnantmicenumberInfertilityrate(%)MeannumberbornP1)IMControl660533±115IMCZP350μg660417±223EPControl660533±044EPCZP35μg65167417±183050EPCZP310μg660367±144EPCZP320μg626773±2003EPCZP350μg626772±2003

Note：IM.Intramuscular inject；EP.Electric pulse.Infertility rate = the amount of unbearing mice/the amount of female mice every group;The mean number born of each immune group show with mean ± SEM;1)pcDNA3-CZP3 group，pcDNA3.0 group vs normal saline group,infertility percent conduct Chi-square test.

图3 电脉冲免疫CZP3 DNA疫苗的小鼠抗体效价检测Fig.3 Detection of antibody titer on electric impulsed CZP3 groupNote: **.P<0.01, immune CZP3 DNA vaccine group is significantly different with negative group, statistical result analyzed by Chi-square test.

2.4 抗生育水平检测 所有免疫组与其对照组相比小鼠的平均产仔数都有所减少，随着免疫水平的提高，平均产仔数逐渐下降。免疫组小鼠生育率也随着抗体水平的提高而降低，其中，20 μg、50 μg电脉冲法免疫组的小鼠生育率与对照组相比差异显著(0.01

2.5 抗体水平与抗生育能力的相关性 对初免后第9周以电脉冲法免疫各组的产仔鼠平均数和抗体水平检测结果(表2和图2B)进行相关性分析。统计分析结果显示，相关系数为-0.976，P=0.004<0.01，相关系数具有显著统计学意义。表明抗CZP3抗体水平与小鼠产仔数呈高度负相关，在一定范围内，抗CZP3抗体水平越高，小鼠的产仔数越少，疫苗的免疫不育效果越好。

3 讨论

DNA疫苗肌肉注射免疫后，DNA质粒被肌肉细胞和单核细胞吸收并在其内表达。表达的抗原肽与肌肉细胞上的MHCⅠ分子或与抗原递呈细胞上的MHCⅠ和 MHCⅡ结合，抗原递呈细胞也可以直接从转染细胞分泌物或从转染引起凋亡的肌肉细胞中捕获抗原蛋白[17,18]。结合了抗原的抗原递呈细胞到达引流淋巴结，从而激活B细胞和T细胞，诱导产生体液免疫应答和细胞免疫应答。但是DNA疫苗常规免疫方法的递呈效率较低，抗原表达数量非常有限，导致DNA疫苗的免疫效果比传统的蛋白疫苗逊色很多。电脉冲免疫首先将质粒DNA注射进入靶组织，随后进行电激。通过电脉冲将细胞膜暴露于电场条件下，变为极化膜，增强膜的通透性，降低负电荷DNA质粒进入双分子层所需的能量[19]，从而增强DNA疫苗的免疫效果[20,21]。电脉冲免疫pcDNA3-CZP3 50 μg组无论是与注射免疫pcDNA3-CZP3 50 μg组还是与对照组相比，都能够显著提高免疫应答水平，降低出生率与平均产仔数。注射免疫pcDNA3-CZP3 50 μg组与对照组相比虽然也能降低平均产仔数，但是其避孕效果与电脉冲免疫pcDNA3-CZP3 50 μg组相比还是相差较远。这也证实电脉冲确实可以增加细胞对于质粒DNA的吸收，提高了抗原递呈细胞的DNA疫苗的递呈效率，从而能够诱导较强的免疫应答。

通常DNA疫苗注射所用的免疫剂量为100 μg/只小鼠，而在本次研究中仅用50 μg DNA质粒电脉冲免疫小鼠所产生的免疫应答水平就远远高于普通注射小鼠，同时能显著降低小鼠的出生率及平均产仔数，证明了电脉冲这种免疫方式可以显著增强DNA疫苗的免疫效果。虽然电脉冲免疫组产生了较高的抗体滴度，但是其避孕效果并没有达到100 %，这可能因为我们此次免疫小鼠的DNA避孕疫苗的抗原是CZP3，而CZP3与小鼠的ZP3同源性为66.8%，相似程度并不是很高，因而在小鼠体内，CZP3 DNA疫苗表达的抗原蛋白的生物活性不高。因此要全面评价CZP3 DNA避孕疫苗的避孕效果，最终应对靶动物犬进行免疫。电脉冲法免疫大大降低了免疫动物对DNA疫苗剂量的要求，在较低免疫剂量的条件下就可以产生更为强烈的免疫应答，为犬避孕DNA疫苗的进一步应用奠定了一定的基础。

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[收稿2016-07-04 修回2016-11-08]

(编辑 倪 鹏)

Efficacy of CZP3 DNA vaccine immune infertility enhanced by electric pulse method

WANGYing，ZHANGBei-Bei，ADILA·Aipire，ZHANGJi，LUOJiao-Jiao，ZHANGFu-Chun.

XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourceandGeneticEngineering,CollegeofLifeScienceandTechnology,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China

Objective:To analyze the immunocontraceptive efficacy of CZP3 DNA vaccine by electric pulse stimulating and the correlation between antibody level and antifertility.Methods: The mice were immunized with 5,10,20 and 50 μg DNA vaccine pcDNA3.0-CZP3 respectively and were stimulated at leg muscle by electric pulse.Detect the antibody level of each mice group and the highest antibody titer by ELISA.After mated with male mice for three weeks,calculated infertility rate of mice，the average litter size of each immune group and did statistical analysis.Results: Compared with the intramuscular injection alone,the electric pulse stimulation could increase serum antibody titers of mice significantly,the antibody titer of 50 μg group which was stimulated by electric pulse reached 1∶4 000.Moreover,the infertility of the mice increased and the mice average litter size reduced along with the increase of CZP3 antibody level significantly.Statistical analysis showed that the antibody level and the average litter size had a negative correlation.Conclusion: The electric pulse stimulation can improve the immune level and reduce the fertility efficiency of mice significantly,therefore establishes a foundation for further application of CZP3 DNA vaccine in stray dog contraception.

Canine zona pellucida 3;DNA vaccine;Electric pulse method;Immune antifertility

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.015

王 颖(1980年-)，女，博士，主要从事分子免疫学方面研究，E-mail: 328532518@qq.com。

及指导教师：张富春(1962年-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事分子免疫学方面研究，E-mail:zfcxju@qq.com。

Q819 R392-33

A

1000-484X(2017)02-0237-05

①本文为新疆维吾尔自治区科技支疆项目(No.201591134)。