袁 芬

(华中科技大学同济医学院附属梨园医院麻醉科，武汉430077)

七氟烷对新生大鼠学习记忆功能以及海马区凋亡的影响

袁 芬

(华中科技大学同济医学院附属梨园医院麻醉科，武汉430077)

目的：观察并探讨新生大鼠接受七氟烷麻醉后，生长至断乳期的学习记忆功能的变化以及海马区神经元细胞凋亡的变化。方法：健康6～8日龄新生SD大鼠100只，随机数字表法分成5组，每组20只：Ⅰ组大鼠吸入体积分数为3%的七氟烷以及25%氧气2 h；Ⅱ组大鼠仅吸入25%氧气2 h；Ⅲ组大鼠分别在出生后第6、7、8天接受一次体积分数为3%的七氟烷以及25%氧气2 h；Ⅳ组大鼠仅吸入3次25%氧气2 h；Ⅴ组大鼠仅放入麻醉箱，不做任何处理。麻醉后待大鼠生长至16～21 d时，采用Morris水迷宫实验检测大鼠的空间学习和记忆能力，并且取大鼠海马区检测caspase-3的表达，用TUNEL法观察海马区凋亡细胞的变化。结果：①Morris水迷宫实验显示：在大鼠生长至16～21 d时进行定向航行实验，与第Ⅳ组大鼠相比，第Ⅰ组大鼠的逃避潜伏期无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；第Ⅲ组大鼠的逃避潜伏期明显延长，和其他组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；②在水迷宫的空间探索实验中，与第Ⅳ组相比，第Ⅰ组大鼠的穿越平台的次数无明显的变化；第Ⅲ组大鼠穿越平台的次数明显减少，并且较第Ⅰ组以及其他各组大鼠也显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)；③第Ⅲ组大鼠的游泳速度明显慢于其他组别；④与第Ⅳ组大鼠比，Ⅰ组大鼠caspase-3的表达稍有增加，Ⅲ组大鼠caspase-3的表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。⑤仅接受一次七氟烷麻醉的大鼠海马区染色阳性的细胞稍有增加，而接受三次七氟烷麻醉的大鼠海马区染色阳性的细胞明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：新生6～8 d的大鼠接受三次七氟烷麻醉后，待其生长至16～21 d，其空间学习记忆能力明显受到影响，可能与海马区神经元细胞凋亡有关。

七氟烷；海马区；学习记忆功能；凋亡

随着医学技术和麻醉学的发展，越来越多的婴幼儿甚至新生儿可以在安全无痛的条件下接受手术以及一些特殊的检查[1,2]。并且有报道显示，约有2%的孕妇在妊娠期需要接受全身麻醉下进行的手术，这使得胎儿暴露于麻醉药物中[3,4]，而这些药物会不会对新生儿、婴幼儿后期的学习记忆能力产生影响，造成损害目前还没有确切的定论。七氟烷是目前在婴幼儿麻醉中应用最为广泛的吸入性麻醉药之一，它对呼吸道的刺激较小，并且在麻醉的诱导过程平稳、苏醒迅速。与其他的吸入性麻醉药相比，七氟烷的肺泡内浓度与吸入浓度比例(FA/F1)较氟烷和恩氟烷高，且排泄迅速[5,6]。但是，在国外，麻醉药对认知功能的影响主要集中在氟烷以及异氟烷的领域[7]，在国内七氟烷对认知功能的影响主要是以中青年鼠或老年鼠为研究对象[8]，而七氟烷对新生儿、婴幼儿的影响以及学习记忆功能研究较少。有研究发现，出生7 d的雄性大鼠分别给予七氟烷麻醉和异氟烷麻醉后，两组大鼠的大脑神经元均有凋亡的表现，但是在等效的浓度刺激下，异氟烷引起的神经元损伤较七氟烷更重。那么七氟烷对发育期的大脑神经元影响多大，仅接受一次七氟烷麻醉和接受多次七氟烷麻醉引起的神经元损伤是否相同,就成了研究者关心的问题之一。有研究表明，阿尔兹海默病患者认知功能障碍的最主要原因是大脑胆碱能突触的神经冲动传递受损[9]，并且研究证实了如果给老年人使用拟胆碱药，可以有效地增强老年人的认知能力。在动物实验中，研究者们也发现老年雄性大鼠在接受异氟醚麻醉后，其空间学习的记忆能力是下降的，可能与大脑海马内胆碱能神经递质的浓度下降有关[10]。当然，由于老年人的生理特点决定了其麻醉后大脑神经系统的影响比中青年人更为敏感，而处于生长发育期的新生动物麻醉后大脑神经系统是否会受到影响还不明确。给予正处于神经突触发育高峰期的大鼠以七氟烷麻醉是否影响生长发育后期的学习记忆功能值得研究。本研究主要观察新生大鼠在接受不同浓度的七氟烷麻醉后，生长至断乳期的学习记忆能力的变化，并进一步研究其大脑海马区中caspase-3的改变，以期能为七氟烷影响发育期大脑学习记忆功能的机制提供实验依据，为七氟烷更安全有效地应用于临床麻醉提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康6～8日龄新生SD大鼠100只，体重为13～20 g，将大鼠饲养于清洁级动物房，大鼠由江苏省扬州大学实验动物中心提供，实验过程中对动物的处理通过了扬州大学实验动物中心的动物实验伦理委员会的审批，审批号为：IACUC-14030070,符合动物伦理学标准。

将大鼠按随机数字表法分成5组，每组20只：Ⅰ组大鼠吸入体积分数为3%的七氟烷以及25%氧气2 h；Ⅱ 组大鼠仅吸入25%氧气2 h；Ⅲ 组大鼠分别在出生后第6、7、8天接受一次体积分数为3%的七氟烷以及25%氧气2 h；Ⅳ组大鼠仅吸入3次25%氧气2 h；Ⅴ组大鼠仅放入麻醉箱，不做任何处理。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宫实验[11,12]Morris水迷宫是一个直径为120 cm，高为50 cm的圆形水桶，其中有可移动的水下平台、图像采集以及分析软件。水池的上方设置东、南、西、北4个方向标记，每两个方向之间的距离相等，这4个方向在水面和水底的投影点将水桶分成4个均等的象限，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限。在实验的过程中，水桶内加入氧化钛使得水变成不透明的乳白色，并将一个直径为6 cm的平台放置于水面下2 cm。水温保持在25℃，图像分析仪(CEFET,Curitiba,PR,Brazil)将自动记录大鼠从投入水桶到找到平台的时间、速度以及游泳的距离。

在大鼠出生后第16～21天开始为期6 d的水迷宫实验。前5 d进行定向航行实验训练，即每次将大鼠从不同象限面向池壁放入水中，记录大鼠寻找到水下平台的时间，若大鼠超过120 s还未能找到平台，用木棍指引其游上平台并停留20 s，此次逃避潜伏期(Escape lantency，EL)记为120 s，每天进行4次，第6天进行定向航行实验以及空间探索实验，将水下平台取出，记录大鼠寻找水下平台的时间以及在120 s内穿越原平台的次数以及原平台象限活动的时间，共4次。测试期间需保持实验室内环境安静、灯光昏暗并无特殊气味，以减少对实验的干扰。

1.2.2 检测caspase-3的表达 在大鼠进行水迷宫实验后30 min，断颈法处死大鼠，取脑组织用生理盐水冲洗后在显微镜下解剖游离出双侧海马组织并做好标记，全过程在冰上进行。用蛋白定量试剂盒(P0010S,Beyotime Institute of Biotechnology,China)检测总蛋白浓度后进行SDS-PAGE电泳，转膜后用5%脱脂奶粉封闭，室温放置2 h，与caspase-3的单抗(1∶1 000;Abcam ab47131) 4℃孵育过夜，用含0.05%Tween-20的TBS冲洗3次，每次10 min，用HRP标记的二抗反应1 h，用TBST冲洗3次，每次10 min，用DAB显色，用凝胶图像分析仪分析蛋白含量(Bio-rad,USA)。

1.2.3 TUNEL法检测海马区神经元细胞凋亡 取大鼠脑组织放入4%的多聚甲醛中固定24 h，采用冰冻切片机切取冠状脑片置于载玻片上，每只大鼠5张切片，用4%多聚甲醛固定脑片15 min，用PBS溶液冲洗两次，每次5 min，加入溶液(乙醇∶醋酸=2∶1)固定5 min，再次用PBS溶液冲洗2次，每次5 min，用3%过氧化氢溶于甲醇溶液浸洗15 min，用PBS溶液冲洗两次，每次5 min，最后加入0.1%TritonX-100溶于0.1%柠檬酸钠溶液促渗2 min，再次用PBS溶液漂洗，每个样本滴加50 μl Taq酶，充分反应60 min后用PBS溶液漂洗，加入荧光素标记液50 μl，再次用PBS溶液冲洗两次后，加入DAB工作液50 μl室温孵育显色，PBS漂洗3次，用苏木素复染几秒后用自来水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明后封片观察。

在光学显微镜(Olympus，BX43)下观察、计数凋亡细胞，每只大鼠取5张切片，每张切片随机选择5个高倍视野，计数其中的阳性细胞数量，染色阳性细胞的胞浆为棕褐色，即凋亡细胞。

2 结果

2.1 水迷宫平均逃避潜伏期的比较 各组水迷宫平均逃避潜伏期资料见图1。结果显示与第Ⅳ组大鼠相比，第Ⅰ组大鼠的逃避潜伏期无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；第Ⅲ组大鼠的逃避潜伏期明显延长，和其他组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 水迷宫空间探索实验结果比较 各组水迷宫空间探索实验资料见图2。结果显示与第Ⅳ组相比，第Ⅰ组大鼠的穿越平台的次数无明显的变化；第Ⅲ组大鼠穿越平台的次数明显减少，并且较第Ⅰ组以及其他各组大鼠也显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3 大鼠运动能力的比较 第Ⅲ组大鼠的游泳速度在第1～5天均慢于其他组别。其中，第2、3、5天较第Ⅳ组明显减慢，差异有统计学意义(P<0.05)，其他组别的游泳速度差异均无统计学意义(P>0.05)，见图3。

图1 大鼠平均逃避潜伏期Fig.1 Mean escape latency in ratsNote: *.P<0.05.

2.4 小鼠海马区caspase-3的表达 在以上的实验中，我们发现接受3次七氟烷麻醉的大鼠在逃避潜伏期、空间探索实验以及运动能力均较其他组有差异，为了进一步了解大鼠在接受七氟烷麻醉后是否发生神经系统细胞凋亡的现象，检测了大鼠海马区caspase-3的表达，见图4。与第Ⅳ组大鼠相比，仅Ⅰ组大鼠caspase-3的表达稍有增加，但是差异无统计学意义，Ⅲ组的大鼠caspase-3的表达明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 大鼠穿越平台次数Fig.2 Time of cross platform in ratsNote: *.P<0.05.

图3 大鼠游泳速度Fig.3 Swimming speed in rats

图4 Western blot检测caspase-3的表达Fig.4 Expression of caspase-3 detected by Western blot

图5 海马区TUNEL染色Fig.5 TUNEL staining in hippocampus

图6 TUNEL染色阳性细胞统计图Fig.6 Statistical map of positive cells of TUNEL stainingNote: *.P<0.05.

2.5 Tunel染色检测大鼠海马区凋亡细胞 由于在上一个实验中，我们发现接受七氟烷麻醉的大鼠caspase-3的表达增加，接下来在细胞层面上，我们用Tunel染色观察大鼠海马区的凋亡，发现，与蛋白的结果一样，仅接受1次七氟烷麻醉的大鼠海马区染色阳性的细胞稍有增加，接受3次七氟烷麻醉的大鼠海马区染色阳性的细胞明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图5、6。

3 讨论

近年来，有动物实验表明，吸入性麻醉药会对未成熟大脑的神经造成不同程度的损伤，而且在大脑发育的关键阶段，吸入麻醉可导致神经元细胞发生退行性变和凋亡，进而影响神经网络的构建[13]。所以在本研究中，为了了解吸入性麻醉药对大脑发育期的影响，我们选用健康6～8日龄新生SD大鼠作为研究对象，这个时期正是大鼠大脑神经突触发育的高峰期[14]。研究表明，学习和记忆的过程主要与大脑皮质联合区、下丘脑、丘脑、海马等脑区的参与有关，其中海马区是由中间脑皮质分化而来的结构，并且被公认为在陈述性记忆中发挥着至关重要的作用，与学习记忆的功能有着非常密切的关系[15]，所以，在本研究中，我们选择海马区域来了解新生大鼠记忆功能的变化、并进一步探究其神经元细胞的凋亡及可能的机制。

目前用于检测动物学习记忆能力的方法有很多，其中Morris水迷宫实验是被公认的用来评价鼠类等啮齿类动物空间学习记忆功能的经典测试方法，其对大鼠的海马组织的损害敏感性很高。Morris水迷宫的操作过程在水中进行，能够避免其他比如电刺激迷宫对实验动物的刺激和伤害，并且能够排除气味对大鼠认知的干扰，Morris水迷宫的测试指标能够比较全面的、系统的评估大鼠空间学习记忆的能力，较为客观的反映大鼠的认知行为水平，所以在以大鼠的海马作为实验对象的研究中，Morris水迷宫实验是一种具有优越性的测试方法。大鼠的空间学习能力越好，其在实验中的逃避潜伏期越短，穿越原平台的次数越多，反之则说明大鼠的空间记忆能力差[16]。在本研究中，我们发现接受一次七氟烷麻醉的大鼠在逃避潜伏期、穿越平台次数以及运动能力方面与未接受麻醉组相比差异均无统计学意义，而接受3次七氟烷麻醉的大鼠在这三个方面较未接受麻醉组均表现出明显的能力降低，提示接受3次七氟烷麻醉的大鼠在早期空间学习记忆能力受损。

以上的结果提示大鼠在麻醉后早期神经元细胞可能发生变化导致大鼠的空间学习能力降低，而且上述结果仅是对大鼠的行为作观察和研究，接下来，我们分别从蛋白层面和细胞层面上观察麻醉后早期大鼠海马区的变化，结果发现，接受3次七氟烷麻醉的大鼠的海马区caspase-3的表达明显增加，并且观察到明显的神经细胞凋亡，提示接受多次七氟烷麻醉会使大鼠的大脑神经元细胞凋亡增多。

尽管在大鼠的模型上，我们发现多次七氟烷麻醉会使得大鼠的神经元细胞凋亡，进而导致学习记忆能力受损，但是七氟烷是否会对婴幼儿产生同样的影响还需要更多的实验研究，本研究着眼于多次七氟烷麻醉对大鼠的学习记忆功能的影响，期望能为临床工作找到安全可靠的麻醉药物，并为寻找较小神经中枢毒性麻醉药物提供实验依据。

[1] Bang SR.Neonatal anesthesia:how we manage our most vulnerable patients[J].Korean J Anesthesiol,2015,68(5):434-441.

[2] Chin C.ABCs of neonatal cardiac anesthesia[J].Artif Organs,2013,37(1):100-102.

[3] Rex S,Devroe S.Anesthesia for pregnant women with pulmonary hypertension[J].Curr Opin Anaesthesiol,2016,29(3):273-281.

[4] Chow L,Farber MK,Camann WR.Anesthesia in the pregnant patient with hematologic disorders[J].Hematol Oncol Clin North Am,2011,25(2):425-443.

[5] Makaryus R,Lee H,Feng T,etal.Brain maturation in neonatal rodents is impeded by sevoflurane anesthesia[J].Anesthesiology,2015,123(3):557-568.

[6] Perbet S,Fernandez-Canal C,Pereira B,etal.Evaluation of richmond agitation sedation scale according to alveolar concentration of sevoflurane during a sedation with sevoflurane in icu patients[J].Intensive Care Med Exp,2015,3(S1):A27.

[7] Arslan M,Isik B,Kavutcu M,etal.Oxidative stress and antioxidant activity of female rat liver tissue after sevoflurane anaesthesia:young versus old[J].Bratisl Lek Listy,2012,113(12):702-706.

[8] Li H,Zhou C,Chen D,etal.Failure to protect against myocardial ischemia-reperfusion injury with sevoflurane postconditioning in old rats in vivo[J].Acta Anaesthesiol Scand,2013,57(8):1024-1031.

[9] Silva MR,Moser D,Pflüger M,etal.Self-reported and informant-reported memory functioning and awareness in patients with mild cognitive impairment and Alzheimer′s disease[J].Neuropsychiatr,2016,30(2):103-112.

[10] Tsartsalis S,Panagopoulos PK,Mironidou-Tzouveleki M.Non-cholinergic pharmacotherapy approaches to Alzheimer′s disease:the use of non-steroidal anti-inflammatory drugs[J].CNS Neurol Disord Drug Targets,2011,10(1):133-139.

[11] Dubue JD,McKinney TL,Treit D,etal.Intrahippocampal anisomycin impairs spatial performance on the morris water maze[J].J Neurosci,2015,35(31):11118-11124.

[12] Adelson PD,Fellows-Mayle W,Kochanek PM,etal.Morris water maze function and histologic characterization of two age-at-injury experimental models of controlled cortical impact in the immature rat[J].Child′s Nerv Syst,2013,29(1):43-53.

[13] Zurek AA,Yu J,Wang DS,etal.Sustained increase in alpha5GABAA receptor function impairs memory after anesthesia[J].J Clin Invest,2014,124(12):5437-5441.

[14] Lunardi N,Hucklenbruch C,Latham JR,etal.Isoflurane impairs immature astroglia development in vitro:the role of actin cytoskeleton[J].J Neuropathol Exp Neurol,2011,70(4):281-291.

[15] Choi J,Shooshtari P,Samocha KE,etal.Network analysis of genome-wide selective constraint reveals a gene network active in early fetal brain intolerant of mutation[J].PLoS Genet,2016,12(6):e1006121.

[16] Akar F,Mutlu O,Celikyurt IK,etal.Effects of rolipram and zaprinast on learning and memory in the Morris water maze and radial arm maze tests in naive mice[J].Drug Res(Stuttg),2015,65(2):86-90.

[收稿2016-08-02 修回2016-09-11]

(编辑 倪 鹏)

Effect of sevoflurane on learning and memory function and apoptosis of hippocampus in infant rats

YUANFen.

DepartmentofAnesthesiology,LiyuanHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430077,China

Objective:To explore the effect of sevoflurane on learning and memory function and apoptosis of hippocampus in infant rats.Methods: 100 SD rats aged 6-8 days were randomly divided into 5 groups(n=20),the group Ⅰinhaled 3% sevoflurane and 25% oxygen for 2 hours;the group Ⅱinhaled only 25% oxygen for 2 hours;the group Ⅲ inhaled 3% sevoflurane and 25% oxygen for 2 hours on the 6th,7th,8th day after birth;the group Ⅳ inhaled 25% oxygen for 2 hours on the 6th,7th,8th day after birth;group Ⅴ were just put into the anesthetized box without any treatment.When the rats were grown up to 16-21 days after anesthesia,the effect of learning and memory function were assessed by Morris water maze test,and activity of caspase-3 were detected by Western blot,the apoptosis of hippocampus were detected by tunnel.Results: ①Compared to group Ⅳ,the mean escape lantency of group Ⅰ showed no significant changes(P>0.05),while group Ⅲ was significant longer (P<0.05),which was significant different from other groups(P<0.05).②In the space exploration experiment,there was no difference between group Ⅰ and Ⅳ,but compared to group Ⅰ and other groups,the number of cross platform of group Ⅲ was decreased (P<0.05).③The swimming speed of group Ⅲ was significantly slower than the other groups.④Compared to group Ⅳ,the activity of caspase-3 slightly increased in group Ⅰ,and significantly increased in group Ⅲ(P<0.05).⑤The positive cells in hippocampus stained by TUNEL in group Ⅲ was significant increased (P<0.05).Conclusion: Learning and memory function of infant rats aged 6-8 days are impaired after three exposures to sevoflurane when they grow up to 16-21 days,and this may relate to the apoptosis of hippocampus.

Sevoflurane;Hippocampus;Learning and memory function;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.008

袁 芬(1978年-)，女，主治医师，主要从事麻醉方面的研究，E-mail:yuanfenfen_2007@163.com。

R392.32

A

1000-484X(2017)02-0201-05