夏法刚，衷兴旺，吴锋，季彪俊



武夷岩茶种质资源遗传多样性与亲缘关系的SRAP分析

夏法刚1，衷兴旺2，吴锋1，季彪俊1

1. 福建农林大学作物科学学院，福建福州350002；2. 武夷山市茶叶产品质量检验所，福建武夷山354300

本研究利用SRAP-PCR反应体系，从88对SRAP引物组合中筛选出43对引物组合，对武夷岩茶主要的30份种质资源进行SRAP分析，共扩增出385条带，其中具有多态性的有236条带，占总数的61.30%，表明30份武夷岩茶种质呈现一定的遗传多样性。武夷岩茶种质资源间遗传距离变幅在0.31~0.98之间，平均为0.63，基于SRAP标记利用系统聚类法把武夷岩茶分为三大类，为武夷岩茶遗传研究、品种选育与资源保护提供参考。

武夷岩茶；种质资源；SRAP标记；遗传多样性；亲缘关系

武夷山是乌龙茶的发源地，保存有大量茶树种质资源，是乌龙茶种质保存的核心区[1]。武夷岩茶的品质主要取决于茶树品种和其独特的制作工艺。其中，起决定作用的是茶树品种的特征品质。武夷山独特的环境条件孕育了大量优质茶树种质资源，素有“茶树品种王国”之称[2]，但这些优质的种质资源需进一步开发利用[3]，才能充分发挥其优势。目前国内外学者对武夷岩茶的生物学特性[1]、营养成分[4]、烘焙技术[5-6]、品质形成[7-8]等方面进行了大量的研究，但对武夷岩茶种质资源遗传多样性方面的研究比较少。本研究以武夷岩茶中主要的30份种质资源为研究对象，通过SRAP分子标记技术对武夷岩茶的遗传多样性进行研究，为武夷岩茶种质资源的鉴定和评价奠定基础，并从中筛选优质资源，为武夷岩茶种质资源的保护、利用和遗传改良等方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

30份武夷岩茶种质资源试验材料收集自武夷山茶叶科学研究所资源圃，各材料编号见表1。

表1 试验材料名称及编号

1.2 试剂与仪器

Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR buffer、MgCl2及标准分子量（Marker）B030t和植物基因组DNA提取试剂盒等购自鼎国生物技术有限公司，溴酚蓝、氯化钠、β-巯基乙醇、无水乙醇、异戊醇等其他试剂均为国产分析纯。

PCR仪为美国伯乐（BIO-RAD）S1000 Thermal Cycler，电泳仪采用北京六一仪器厂生产的DYY-5型稳压稳流电泳仪，索福Legend Micro17微量台式离心机，eppendorf 5415R冷冻离心机，DYY-6C型电泳仪，美国伯乐（BIO-RAD）凝胶成像仪，电热恒温水浴锅，eppendorf移液枪，冰箱，微波炉，高压灭菌锅等。

1.3 引物

SRAP正反向引物采用Li和Quiros[9]、Vandemark等[10]和Ferriol等[11]发表的引物序列（表2），SRAP引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 试验方法

1.4.1 基因组DNA的提取步骤

基因组DNA提取按照试剂盒说明进行。

1.4.2 DNA质量检测

电泳检测提取的基因组DNA质量，紫外分光光度计检测茶叶基因组DNA浓度：将待测样品适当稀释（茶叶DNA 10 μL用TE缓冲液稀释至2 000 μL）后，TE缓冲液进行调零，设定紫外光波长，分别测定230、260、280 nm波长时的OD值，并计算DNA的纯度和浓度。根据计算的浓度稀释至20 mg·L-1，然后放入－20℃保存备用。

1.4.3 SRAP-PCR体系

SRAP扩增反应体系：Mg2+浓度3.0 mmol·L-1，Taq酶2.0 U，dNTPs浓度0.2 mmol·L-1，引物浓度2.0 μmol·L-1，10×Buffer 2.0 μL，模板DNA 20 ng；反应总体积为25 μL。经过重复试验，确定SRAP-PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃延伸100 s，5个循环；94℃变性1 min，50℃复性1 min，72℃延伸100 s，35个循环；最后72℃延伸5 min。对30份资源DNA进行SRAP扩增，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行检测。

表2 武夷岩茶遗传多样性研究的SRAP引物序列

1.4.4 种质资源遗传多样性分析

引物序列见表2。首先从30份茶树种质资源中选出6份形态特征差别比较大的2、3、6、7、8、16共计6个品种，对88对引物进行筛选，从88对引物中筛选出多态性高、重复性好的引物用于PCR扩增。反应体系见1.4.3，扩增产物经7.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，进行观察并拍照。

1.4.5 数据统计和分析

对获得的SRAP-PCR扩增条带进行统计，在相同迁移位置，当出现清晰可辨的电泳条带时标记为1，模糊或不存在条带记为0。通过DPS7.05计算各品种之间的遗传距离，将数据导入MEGA7，构建进化树[12]。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的提取与检测

利用试剂盒提取的茶叶DNA整体质量良好，DNA拖尾现象不明显（图1中的1~10泳道），证明RNA的干扰比较小，DNA的条带整体清晰、带型好，而且DNA溶液呈无色透明，说明DNA中杂质较少，可用于进行SRAP相关试验。

2.2 SRAP多态性引物的筛选

首先从30份茶树种质资源中选出6份形态特征差别比较大的2、3、6、7、8、16共计6个品种对88对引物进行筛选，从88对引物中筛选出多态性高、重复性好的43对引物用于PCR扩增。利用上述6个品种分别对Me8/Em7、Me8/Em8、Me8/Em9、Me8/Em10、Me8/Em11共5对引物进行筛选（图2）。从图中可以看出，Me8/Em7、Me8/Em9、Me8/Em10、Me8/Em11这4对引物扩增的多态性比较高。从88对引物中共筛选出多态性高的43对引物，并用这43对引物对30份乌龙茶种质资源进行扩增。

2.3 武夷岩茶种质资源的SRAP扩增结果

用获得的43对能产生清晰可辨别扩增条带的引物组合对30份武夷岩茶种质进行扩增，共扩增出385条带，其中具有多态性的有236条，占总数的61.30%，表明30份武夷岩茶种质呈现一定的遗传多样性。平均来看，每对引物可扩增出8.95条带，其中具有多态性的有5.49条带。43对SRAP引物扩增的条带见表3。其中Me3/Em6这对引物扩增出15条带，在所有引物中扩增出条带数最多。

注：M：DL15000，1~10泳道：1~10号乌龙茶基因组DNA。

注：品种从左到右依次为2、3、6、7、8、16，引物分别为Me8/Em7、Me8/Em8、Me8/Em9、Me8/Em10、Me8/Em11。

2.4 武夷岩茶种质资源的遗传距离分析

利用DPS7.05版本计算武夷岩茶种质资源间的平均遗传距离，遗传距离变幅在0.31~0.98之间，平均为0.63，说明武夷岩茶种质资源间遗传差异较大。根据遗传距离矩阵表计算出30份武夷岩茶种质资源间的平均遗传距离（表4）在0.53~0.95之间。其中1号平均0.95，排在第1位，11号和24号排在第2和第3位，分别达到0.76和0.71，说明这3个种质资源与其他种质资源的差异较大，关系较远。

2.5 基于SRAP的30份武夷岩茶种质资源聚类分析

将获得的武夷岩茶种质资源的SRAP标记转化成[0, 1]原始矩阵，并通过DPS7.05计算出遗传距离，将数据导入MEGA7，构建系统树（图3）。从图中可以看出，30份武夷岩茶可分为三大类，其中1号北斗单独归于第I类群，北斗原产北斗峰，后经引种栽培，与其他武夷岩茶种质资源差异较大，性状特征差别也比较明显。11号半天妖和17号奇兰归为第Ⅱ类群，半天妖为武夷山传统五大名丛之一，原产三花峰之第三峰绝顶崖上，相传“此茶非人所植，系古时飞鸟由他山喙衔茶籽，落此生成”，因此与其他种质资源区别比较大。剩余27份种质资源归于第Ⅲ类群，其中26号梅占与29号金毛猴遗传亲缘关系较近，8号水金龟和21号黄玫瑰、4号矮脚乌龙和27号毛蟹、9号金锁匙和22号丹桂亲缘关系较近，18号金牡丹、19号金观音和20号黄观音都是铁观音的后代，因此遗传亲缘关系也较近。

表3 43对引物组合的SRAP扩增结果及多态性信息

表4 30份武夷岩茶种质资源与其他种质资源的平均遗传距离

3 讨论

SRAP标记是根据基因的外显子和内含子特点设计引物进行PCR扩增的一种分子标记技术，具有稳定、简单、快速、高效等优点，已在玉米[13]、小麦[14]、青稞[15]等粮食作物的遗传多样性分析中证实。沈程文等[16-17]利用SRAP技术对广东25份地方茶树种质资源和5个不同地区的对照品种进行了遗传多样性研究，发现广东茶树种质资源间存在一定的遗传多样性，共扩增出127条带，多态性比率达88.67%，证明了SRAP标记在茶树种质资源分析中的可行性。

武夷岩茶种质资源遗传多样性研究未见相关报道，本研究利用43对SRAP引物组合对30份武夷岩茶种质进行扩增，共扩增出385条带，其中具有多态性的有236条，占总数的61.30%。平均来看，每对引物可扩增出8.95条带，其中具有多态性的带有5.49条，这与沈程文等[16]对广东茶树（4.83条）种质资源的研究相近，进一步证明了SRAP技术比较适合茶树种质资源的遗传多样性分析。

李振刚[18]通过RAPD分析将30份茶树种质资源中的26份归为一类群，其中部分为目前的主栽品种，亲缘关系较近，而且30份品种中多数原产于安溪。而在本研究中，30份武夷岩茶种质资源有27份归为一大类，这些武夷岩茶种质资源的地理分布与聚类分析并不完全一致，这可能是由于地区间引种交流所致，可能表明福建乌龙茶种质资源和加工技术是由武夷山传播到安溪的传播路径具有一定的关系[19]。种质资源引入后，经过后天的人工选择和种质资源对环境条件选择进化，从而表现出不同的性状特征，由于武夷山和安溪两地的气候条件差异明显，所以茶树种质资源群体间在萌芽期、开花期、种子成熟期、花器、果实、种子等性状等方面存在一定差异[20]。如何筛选优异武夷岩茶种质资源，合理选择优势互补、亲缘关系较远的父母本是当前岩茶茶树育种中的重要问题，SRAP分子标记从分子水平上揭示了品种的特征特性及亲缘关系，具有不受生长发育时期、部位和环境等因素的限制，可以快速、高效、灵敏地鉴定品种间的亲缘关系，结合生物学特征特性进行杂交，可获得遗传基础广泛、变异丰富的后代，从而为新品种选育、品种鉴定和种质保存奠定基础。

图3 乌龙茶种质资源的聚类图

[1] 洪永聪, 卢莉, 辛伟, 等. 武夷岩茶“十大名丛”种质生物学特性的鉴定与评价[J]. 中国农学通报, 2012, 28(28): 234-238.

[2] 曾震中. 茶为山兴山以茶显——武夷山岩茶文化璀灿夺目[J]. 农业考古, 1992(2): 10-13.

[3] 刘辉, 裴礼辉. 武夷岩茶：种质资源宝库待开发[N]. 福建日报, 2014-05-14(3).

[4] 赵峰, 林河通, 杨江帆, 等. 基于近红外光谱的武夷岩茶品质成分在线检测[J]. 农业工程学报, 2014, 30(2): 269-277.

[5] 刘宝顺, 潘玉华. 武夷岩茶烘焙技术[J]. 福建茶叶, 2014, 36(1): 29-31.

[6] 林永胜, 罗婵玉, 陈忠林, 等. 不同精制烘焙工艺对武夷岩茶品质的影响[J]. 福建茶叶, 2016, 38(4): 7-10.

[7] 李少华, 刘安兴, 王飞权. 武夷岩茶制作工艺对茶叶品质的影响[J]. 武夷学院学报, 2015, 34(9): 11-14.

[8] 邓慧莉, 周子维, 王秋铭, 等. 武夷岩茶加工过程β-葡萄糖苷酶对香气形成的影响[J]. 福建茶叶, 2016, 38(2): 1-3, 7.

[9] Li G, Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR reaction: its application to mapping and gene tagging in Brassica [J]. Theor Appl Genet, 2001, 103: 455-461.

[10] Vandemark G J, Ariss J J, Bauchan G A, et al. Estimating genetic relationships among historical sources of alfalfa germplasm and selected cultivars with sequence related amplified polymorphisms [J]. Euphytica, 2006, 152: 9-16.

[11] Ferriol M, Picó B, Nuez F. Genetic diversity of a germplasm collection ofusing SRAP and AFLP markers [J]. Theor Appl Gent, 2003, 107: 271-282.

[12] 李亚玲, 韩国民, 何沙娥, 等. 基于DNA分子标记数据构建系统进化树的新策略[J]. 生物信息学, 2007, 6(4): 168-170.

[13] 黄进勇, 盖树鹏, 张恩盈, 等. SRAP 构建玉米杂交种指纹图谱的研究[J]. 中国农学通报, 2009, 25(18): 47-51.

[14] 王凤涛, 蔺瑞明, 欧阳宏雨, 等. 利用SRAP标记分析河南小麦栽培品种的遗传多样性[J]. 植物遗传资源学报, 2009, 10(4): 517-521.

[15] 杨平, 刘仙俊, 刘新春, 等. 利用SRAP 标记研究四川高原青稞育成品种的遗传多样性[J]. 遗传, 2008, 30(1): 115, 22.

[16] 沈程文, 黄建安, 赵世浩, 等. 利用SRAP和ISSR标记分析广东茶树种质资源的遗传多样性[J]. 核农学报, 2010, 24(5): 948-955.

[17] 沈程文, 宁正祥, 黄建安, 等. 基于表型参数及SRAP标记的广东茶树种质遗传多样性[J]. 应用生态学报, 2009, 20(7): 1551-1558.

[18] 李振刚. 乌龙茶种质资源的RAPD分析与离体保存[D]. 福州: 福建农林大学, 2011: 29-30.

[19] 黄福平, 梁月荣, 陆建良, 等. 乌龙茶种质资源种群遗传多样性AFLP评价[J]. 茶叶科学, 2004, 24(3): 183-189.

[20] 叶乃兴, 郭吉春. 福建茶树品种资源的研究现状与展望[J]. 福建茶叶, 1997, 20(1): 42-45.

SRAP Marker Analysis of Genetic Diversity and Relationship in Wuyi Rock Tea Germplasm Resources

XIAFagang1, ZHONG Xingwang2, WU Feng1, JI Biaojun1

1. Crop Science College of Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Tea products Quality Inspection Institute of Wuyishan City, Wuyishan 354300, China

The genetic diversity and relationship of 30 Wuyi rock tea germplasms were analyzed by Sequence-related amplified polymorphism (SRAP) markers. Forty three pairs of primers selected from 88 pairs of candidate SRAP primers produced 385 amplified fragments. Among them, 236 were polymorphic, accounting for 61.30% of the total fragments. The results showed that there was distinct genetic diversity within Wuyi rock tea germplasms. The genetic distance ranged from 0.31 to 0.98 with an average of 0.63. Thirty Wuyi rock tea germplasms were classified as three categories basing on the UPGMA cluster analysis. This study was of great significance for genetic research, breeding and resource protection of Wuyi rock tea.

Wuyi rock tea, germplasms, SRAP marker, genetic diversity, genetic relationship

S571.1；Q52

A

1000-369X(2017)01-078-08

2016-06-17

2016-08-09

国家质检总局科技计划项目（2013QK311）

夏法刚，男，讲师，主要从事茶树遗传育种及品质分析。E-mail：sdxfm@163.com