儿童急性B淋巴细胞白血病致癌基因FGFR3表达对预后的影响研究

2017-02-17吴静怡周剑峰裴仁治张丕胜刘旭辉杜小红

浙江医学 2017年2期

吴静怡周剑峰裴仁治张丕胜刘旭辉杜小红

吴静怡周剑峰裴仁治张丕胜刘旭辉杜小红

目的分析急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）患儿成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）基因的表达情况，探讨其在疾病预后判断中的意义。方法采用实时定量PCR法检测52例B-ALL患儿（B-ALL组）与12例对照儿童（对照组）骨髓血中B淋巴细胞FGFR3基因表达水平；并以B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平的中位数为界，将B-ALL组患儿分为FGFR3基因高表达组和FGFR3基因低表达组。比较FGFR3基因高表达组和FGFR3基因低表达组患儿的各项临床指标；随访36个月，比较两组患儿的无事件生存（EFS）率。采用流式细胞术检测B淋巴细胞免疫分型、巢式PCR法检测B淋巴细胞融合基因，比较不同B淋巴细胞免疫分型及融合基因的B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平。结果B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平高于对照组儿童（1.637±0.903 vs 0.645±0.559，P＜0.05）。FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿性别、年龄、外周血WBC、肝脾有无肿大、有无髓外浸润、B淋巴细胞免疫分型及染色体核型等临床指标比较均无统计学差异（均P＞0.05）。FGFR3基因高表达组患儿EFS率低于FGFR3基因低表达组患儿（49.97%vs 76.17%，P＜0.05）。B-ALL组患儿中，CD34+患儿FGFR3基因表达水平高于CD34-患儿（P＜0.05），BCR/ABL+患儿FGFR3基因表达水平高于BCR/ABL-患儿（P＜0.05）。结论FGFR3基因高表达与肿瘤发生、发展有关，有望成为辅助评价儿童B-ALL预后的指标。

急性B淋巴细胞白血病 FGFR3 预后

成纤维细胞生长因子受体（FGFR）是一类具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受体，在细胞生长、分化、迁移及血管发生、伤口愈合等生理、病理过程中发挥重要作用[1]。FGFR3是FGFR家族一员，其在膀胱癌中高表达，且与肿瘤转移及淋巴结浸润密切相关[2]。有学者发现约25%多发性骨髓瘤患者发生t（4；14）（p16.3；q32.3）基因易位，导致FGFR3基因过度表达而致瘤[3]。FGFR3基因定位于染色体4pl 6.3，跨越16.5 kb，共含19个外显子，是已被确认的致癌基因。本研究旨在分析FGFR3基因在急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）患儿B淋巴细胞中的表达情况，探讨其在疾病预后判断中的意义，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象选取2006年6月至2015年3月在宁波大学医学院附属鄞州医院初诊的B-ALL患儿52例（BALL组），采用MICM分型诊断。其中男33例，女19例；年龄0.25～16岁，中位年龄10岁；同时记录患儿初诊时外周血WBC、PLT、肝脾有无肿大、有无髓外浸润、B淋巴细胞免疫分型及染色体核型等临床指标。患儿均按《儿童ALL诊疗建议》[4]进行危险度分组，并参照该建议治疗；1个疗程结束后，根据《血液病诊断及疗效标准》[5]评价疗效，随访3年。选取同期健康儿童10例及缺铁性贫血患儿2例作为对照组。本研究经医院医学伦理委员会批准，患儿、对照儿童监护人均知情同意并签署知情同意书。

1.2 试剂和仪器人淋巴细胞分离液购自中国医学科学院生物工程医学研究所，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，RNA酶抑制剂购自华美生物工程公司，M-MLV逆转录酶购自美国Promega公司，Taq DNA聚合酶购自加拿大Fermentas公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix购自上海东洋纺生物科技有限公司，所有流式试剂均购自美国BD公司。PRISM 7300实时定量PCR仪购自美国ABI公司，ChemilmagerTM5500型凝胶成像分析系统购自美国Alpha Innotech公司，四色数字化流式细胞购自美国Beckman Coulter公司。

1.3 方法

1.3.1 FGFR3基因实时定量PCR检测抽取B-ALL组患儿及对照组儿童骨髓血3～5ml，淋巴细胞分离液分离骨髓B淋巴细胞，Trizol一步法抽取总RNA，按试剂盒说明书操作步骤合成cDNA链。FGFR3基因上游引物5′-TTAACACTTCTTACGCAATGCT-3′，下游引物5′-GCCCAGTAACAGTACAGAACGA-3′，扩增片段长度110bp。内参GAPDH基因上游引物5′-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3′，下游引物5'-CATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA-3′，扩增片段长度150bp。20μl反应体系中含 cDNA 2μl、FGFR3及 GAPDH上下游引物（10μmol/L）各0.5μl，每份标本均设2个复孔，每板同时设质控对照组、阳性对照组和阴性对照组。PCR反应条件：95℃预变性10s，95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸10s，40个循环，目的基因和内参基因的扩增效率基本一致。按照相对定量法计算目的基因的相对拷贝数即表达水平，具体公式为2-△△ct，其中△Ct=目的基因Ct值-内参基因Ct值，△△Ct=待测标本△Ct值-标准品△Ct值。并以B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平的中位数为界，将B-ALL组患儿分为FGFR3基因高表达组和FGFR3基因低表达组。

1.3.2 染色体核型分析 24h培养法制备B-ALL组患儿骨髓B淋巴细胞染色体，采用G带技术显带，分析细胞数20个。根据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN1995）》描述核型，包括正常二倍体、超二倍体、亚二倍体、假二倍体。

1.3.3 B淋巴细胞免疫分型检测应用四色数字化流式细胞仪和相应的配套试剂检测B淋巴细胞的免疫分型。所有B-ALL组患儿标本均先以CD45设门，选定CD45弱阳性和侧向角散射较小区域细胞进行分析。

1.3.4 B淋巴细胞融合基因检测参照文献[6]报道的巢式PCR方法，同时检测B-ALL组患儿骨髓B淋巴细胞融合基因。扩增产物取10μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像扫描系统分析，根据特异条带的有无分别记为阳性和阴性。

1.4 观察指标（1）比较B-ALL组患儿与对照组儿童FGFR3基因表达水平。（2）比较FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿各临床指标（性别、年龄、外周血WBC、肝脾有无肿大、有无髓外浸润、B淋巴细胞免疫分型及染色体核型）。（3）患儿随访36个月，中位随访时间18个月，观察比较FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿疾病预后。其中无事件生存（EFS）率定义为患儿自确诊之日起至任何事件发生（包括复发、第二肿瘤或死亡）或末次随访日期，若患儿治疗效果未达完全缓解，其EFS率为0.00%。（4）比较不同B淋巴细胞免疫分型及融合基因的 B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平。

1.5 统计学处理应用SPSS16.0统计软件；计量资料以表示，两组比较采用t检验；计数资料以构成比表示，两组比较采用χ2检验或Fisher确切概率法。采用Kaplan-Meier法估计患者的EFS率并绘制生存曲线，两组患者EFS率的比较采用log-rank检验。

2 结果

2.1 B-ALL组患儿与对照组儿童FGFR3基因表达水平比较 B-ALL组患儿与对照组儿童FGFR3基因表达水平分别为1.637±0.903、0.645±0.559，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），即B-ALL患儿FGFR3基因表达水平高于对照儿童。

2.2 FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿各项临床指标比较实时定量PCR检测结果提示，FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿各有26例。两组患儿各临床指标比较见表1。

由表1可见，两组患儿性别、年龄、外周血WBC、肝脾有无肿大、有无髓外浸润、B淋巴细胞免疫分型及染色体核型等临床指标比较均无统计学差异（均P＞0.05）。

2.3 FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿疾病预后比较两组患儿生存曲线见图1。

图1 FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿生存曲线

由图1可见，FGFR3基因高表达组与与FGFR3基因低表达组患儿EFS率分别为49.97%、76.17%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05），即FGFR3基因高表达组患儿EFS率低于FGFR3基因低表达组患儿。

2.3 不同B淋巴细胞免疫分型的B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平比较流式细胞术检测到B-ALL组患儿B淋巴细胞免疫分型包括CD10、CD20、CD22、CD34、CD38。不同B淋巴细胞免疫分型的B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平比较见表2。

表1 FGFR3基因高表达组与FGFR3基因低表达组患儿各临床指标比较[例（%）]

表2 不同B淋巴细胞免疫分型的B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平比较

由表2可见，B-ALL组患儿中，CD34+患儿FGFR3基因表达水平高于CD34-患儿（P＜0.05）。

2.4 不同B淋巴细胞融合基因的B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平比较巢式PCR法检测到BALL组患儿B淋巴细胞融合基因包括HLA-DR、BCR/ ABL及TEL/AML1。不同B淋巴细胞融合基因的BALL组患儿FGFR3基因表达水平比较见表3。

表3 不同B淋巴细胞融合基因的B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平比较

由表3可见，B-ALL组患儿中，BCR/ABL+患儿FGFR3基因表达水平高于BCR/ABL-患儿（P＜0.05）。

3 讨论

FGFR3属于酪氨酸激酶家族，生理条件下与配体结合后形成二聚体，激活细胞内酪氨酸激酶，参与细胞的生长、分化及迁移。在肿瘤组织中，FGFR3基因发生突变导致以受体非依赖的方式异常激活，有研究发现约35%膀胱癌及25%宫颈癌组织存在FGFR3基因的突变[7]。而在血液系统恶性疾病如慢性髓细胞白血病、浆细胞白血病和多发性骨髓瘤中也发现FGFR3基因的过表达[8-9]。如将FGFR3基因高表达的骨髓细胞植入经致死性照射的小鼠体内，所有移植后的小鼠都出现了恶性的血液表型，包括淋巴细胞和髓系的恶性表型[10]。这些前期研究均提示FGFR3作为一种致癌基因与肿瘤的发生、发展密切相关。本研究结果显示，与对照组儿童相比，B-ALL组患儿FGFR3基因表达水平较高。对BALL组患儿的随访也发现，FGFR3基因高表达组患儿EFS率低于FGFR3基因低表达组患儿。

本研究发现B-ALL组患儿中，BCR/ABL+患儿FGFR3基因表达水平高于BCR/ABL-患儿。Dvorakova等[11]发现慢性粒细胞白血病患者治疗后BCR/ABL拷贝数下降，FGFR3基因表达水平明显下降至正常水平，当白血病复发或进入加速期后，FGFR3基因表达水平会随BCR/ABL拷贝数上升而明显升高。两者在肿瘤细胞增殖过程中有明显的相关性，另外值得注意的是BCR/ ABL酪氨酸酶是依赖Ras信号途径激活，而FGFR3基因的激活途径是Ras非依赖性的，因此FGFR3基因的异常激活很可能进一步激活BCR/ABL酪氨酸酶，导致细胞增殖。

本研究亦发现 B-ALL组患儿中，CD34+患儿FGFR3基因表达水平高于CD34-B-ALL患儿。CD34抗原起源于早期造血干细胞，分化成熟后逐渐消失，在儿童ALL中表达明显高于成人。尽管目前儿童急性淋巴细胞白血病中CD34与预后关系尚不明确，但这仍提示来源于早期造血细胞的恶性克隆更容易出现致癌基因FGFR3的异常表达。国外学者在慢性粒细胞白血病患者CD34+细胞及健康供者CD34+外周血干细胞中均发现FGFR3基因的异常高表达[12]，这与本研究观察到的现象一致。

综上所述，本研究结果显示FGFR3基因高表达与肿瘤发生、发展有关，有望成为辅助评价儿童B-ALL治疗效果及预后的指标。FGFR3基因及其表达产物的抑制剂或可作为抗肿瘤治疗重要的靶向药物，值得临床及实验室进一步研究。

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Expression of FGFR3 gene in childhood acute B lymphoblastic leukemia and its relation to disease progression

Objective To investigate the expression of fibroblast growth factor receptors 3(FGFR3)gene in childhood acute B lymphoblastic leukemia(B-ALL),and its clinical significance in disease progression.MethodsThe expression levels of FGFR3 in 52 children with B-ALL and 12 normal children were assayed by real time RT-PCR.Clinical indicators were compared between patients with high FGFR3 expression and those with low FGFR3 expression.Patients were followed up for 36 months. The event-free survival(EFS)rate was compared with single factor analysis between two groups.B lymphocyte immune classification was detected by flow cytometry and B lymphocyte fusion gene was detected by nested PCR.The expression levels of FGFR3 were compared among different immune classification and fusion gene groups.ResultsFGFR3 was over-expressed in children with B-ALL compared with normal controls (1.637±0.903 vs 0.645±0.559,P＜0.05).There were no significant differences in sex,age,peripheral blood WBC count,hepatosplenomegaly,extramedullary infiltration,B lymphocyte immune classification and karyotype between low FGFR3 group and high FGFR3 group(P＞0.05).The probability of 3-year EFS for patients with high FGFR3 level was significantly lower than that with low FGFR3 level(49.97%vs 76.17%,P＜0.05).Expression levels of FGFR3 were significantly different between BCR/ABL+group and BCR/ABL-group(P＜0.05)and between CD34+group and CD34-group(P＜0.05).ConclusionOver-expression of FGFR3 may participate in malignant hematopoiesis and the detection of FGGR3 expression might be helpful in evaluation of disease progression in childhood acute B lymphoblasticleukemia.

Acute B lymphoblastic leukemia Fibroblast growth factor receptor 3 Progression