SU5416对小鼠急性肺损伤后肺纤维化的影响研究

2017-02-17黄旭晴徐长青童岳阳

浙江医学 2017年2期

黄旭晴徐长青童岳阳

黄旭晴徐长青童岳阳

目的探讨血管内皮生长因子（VEGF）受体抑制剂Z-3-[（2，4-二甲基吡咯-5-烃基）亚甲基]-2-吲哚满酮（SU5416）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性肺损伤（ALI）后肺纤维化的影响。方法90只雄性C57BL/6小鼠随机分为LPS模型组（MG组）、SU5416干预组（TG组）和正常对照组（CG组），每组30只。MG组及TG组小鼠经尾静脉注射0.5ml LPS（5mg/kg）建立小鼠ALI模型；CG组以等体积0.9%氯化钠注射液代替。30min后，TG组小鼠即予腹腔注射0.5ml SU5416（50mg/kg），MG组和CG组小鼠则腹腔注射等体积0.9%氯化钠注射液。于第7、14、28天分别处死3组小鼠各10只；行HE及Masson染色观察小鼠肺损伤改变；检测肺组织匀浆中羟脯氨酸水平；免疫组化法测定肺组织VEGF、CD31表达水平。结果MG组小鼠第7天肺损伤明显，肺呈纤维化改变，第28天纤维化进一步加重；同一时间点，MG组及TG组小鼠肺损伤评分、羟脯氨酸水平、CD31及VEGF表达水平均高于对照组（均P＜0.05），而TG组小鼠上述指标均低于MG组（均P＜0.05）。结论SU5416可减轻LPS诱导小鼠ALI后肺纤维化，其可能通过抑制VEGF、CD31表达发挥作用。

血管内皮生长因子受体抑制剂急性肺损伤肺纤维化 VEGF CD31

急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是各种肺内、外致病因素导致的急性弥漫性炎症性肺部损伤，进而引起急性呼吸衰竭；由脓毒症和重症肺炎诱发的ALI/ARDS病死率高达40%～50%[1]。ALI发病一般认为与炎症介质组成的细胞因子网络动态失衡引发机体病理性炎症变化有关[2-3]，炎症介质诱发巨噬细胞浸润，血管内皮细胞高表达血管内皮生长因子（VEGF）受体（VEGFR）[4]。研究发现，博莱霉素损伤肺早期可见肺间质内先是巨噬细胞，随后是肺间质细胞强烈表达VEGF，并伴有肺间质大量新生血管形成[5-6]。羟脯氨酸（HYP）为胶原纤维所特有，可反映纤维化的程度。VEGF的高表达和新生血管形成存在时间剂量依赖性。CD31是新生血管形成的主要标志之一，可反映肺组织新生血管的密度。在ALI早期既有炎症反应，同时又有纤维组织增生及修复[7]。如何防止或减轻ALI远期肺纤维化是改善ALI预后的关键问题。血管内皮生长因子受体抑制剂Z-3-[（2，4-二甲基吡咯-5-烃基）亚甲基]-2-吲哚满酮（SU5416）是一种脂溶性小分子合成受体酪氨酸激酶抑制剂[8]，既可抑制VEGFR-1，也能阻断VEGFR-2。SU5416主要用于抑制肿瘤新生血管形成的研究，其对ALI后肺纤维化的作用研究报道不多。本研究拟以经尾静脉注射脂多糖（LPS）的方法诱导小鼠ALI，通过观察肺损伤改变，检测肺组织HYP、VEGF及CD31水平，探讨SU5416对小鼠ALI后肺纤维化的影响，以期为ALI研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料实验动物：雄性健康清洁级C57BL/6小鼠90只，6～8周龄，体重20～24g，购自南京君科生物工程有限公司。试剂：HYP检测试剂盒购自南京建成生物研究所；SU5416购自美国Santa Crutz公司；LPS购自美国Sigma公司；VEGF及CD31试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型建立将小鼠按随机数字表法分为LPS模型组(MG组)、SU5416干预组（TG组）、正常对照组（CG组），每组30只。小鼠于实验开始前12h禁食，自由饮水。消毒小鼠尾部皮肤，MG组及TG组小鼠经尾静脉注射0.5ml LPS（5mg/kg）建立小鼠ALI模型；CG组以等体积0.9%氯化钠注射液代替。LPS致伤后30min，TG组小鼠即予腹腔注射0.5ml SU5416（50mg/kg），MG组和CG组小鼠则腹腔注射等体积0.9%氯化钠注射液。于第7、14、28天分别处死3组小鼠各10只；取左肺组织行HE及Masson染色观察肺泡炎、肺纤维化及肺损伤改变；免疫组化法检测肺组织CD31及VEGF的表达水平；取右肺上叶制作肺组织匀浆用于HYP含量检测。

1.2.2 肺组织HE、Masson染色在光学显微镜下观察3组小鼠肺组织大体及病理改变（HE染色），确定LPS诱发的小鼠ALI模型是否成功。Masson染色进行胶原纤维及肌纤维的鉴别。

1.2.3 肺损伤程度评判根据以下4项指标进行肺损伤评分[9-10]：（1）肺泡充血；（2）肺出血；（3）肺间隙或血管壁中性粒细胞浸润或聚集；（3）肺泡间隔增厚或透明膜形成。根据每项指标病变轻重进行0～4分半定量分析（无损伤计0分，轻度损伤计l分，中度损伤计2分，重度损伤计3分，极重度损伤计4分），累加各项评分的总分作为肺损伤评分。

1.2.4 肺组织匀浆HYP水平检测准确称取保存备用的湿肺组织30～40mg/只，剪碎后制成匀浆，采用碱水解法测定样本光密度，然后参照HYP检测试剂盒说明书，根据肺组织含量计算HYP水平。

1.2.5 VEGF及CD31表达水平测定采用免疫组化SP法，切片皆采用图像分析软件先进行颜色分离，然后自动计算其积分光密度（IOD）值进行半定量分析。

1.3 统计学处理应用SPSS16.0统计软件；计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 3组小鼠一般情况比较经尾静脉注射LPS后，CG组小鼠呼吸平稳，无口唇发绀、肺出血表现；MG组小鼠48h出现呼吸急促、口唇发绀、肺出血等症状，符合ALI表现；而TG组上述症状有所减轻。

2.2 3组小鼠肺组织病理形态比较 CG组小鼠各时间点肺组织结构完整，肺泡大小均匀，肺泡腔清晰，肺间质及肺泡腔无明显炎性细胞浸润、出血及纤维组织增生。MG组小鼠第7天肺间质水肿、毛细血管扩张充血、大量肺泡腔内可见炎性细胞浸润，可见大量新生血管形成，伴灶性出血、肺气肿及肺不张等ALI改变；第14天时损伤改变分布不均匀，以胸膜下区明显，肺泡间隔轻度增宽、巨噬细胞等炎性细胞浸润明显、胶原纤维沉积少；第28天时肺组织肺泡炎仍较重，部分肺泡腔消失，间质被大量蓝色胶原纤维占据，新生血管减少，破坏严重、纤维化明显、少见炎性细胞浸润，严重纤维化。TG组小鼠第7、14、28天时肺损伤和纤维化均较MG组轻。

2.3 3组小鼠肺组织Masson染色表现比较见图1-3。

由图1-3可见，MG组小鼠可见蓝色胶原沉积明显，并随着小鼠生存时间延长，蓝色胶原沉积加重；CG组小鼠肺组织未见蓝色胶原沉积；TG组小鼠肺组织可见蓝色胶原沉积介于CG组与MG组之间。

2.4 3组小鼠肺损伤评分比较见表1。

由表1可见，3组小鼠第7、14、28天肺损伤评分比较均有统计学差异（均P＜0.05）；MG组与TG组小鼠第7、14、28天肺损伤评分均高于CG组（均P＜0.05）；TG组小鼠第7、14、28天肺损伤评分均较MG组降低（均P＜0.05）。

2.5 3组小鼠肺组织HYP水平比较见表2。

由表2可见，3组小鼠第7、14、28天肺组织HYP水平比较均有统计学差异（均P＜0.05）；MG组与TG组小鼠第7、14、28天肺组织HYP水平均高于CG组（均P＜0.05）；TG组小鼠第7、14、28天肺组织HYP水平均较MG组降低（均P＜0.05）。

图1 MG组肺组织Masson染色表现（a:第7天；b:第14天；c:第28天；×400）

图2 TG组肺组织Masson染色表现（a:第7天；b:第14天；c:第28天；×400）

图3 CG组肺组织Masson染色表现（a:第7天；b:第14天；c:第28天；×400）

表1 3组小鼠肺损伤评分比较（分）

表2 3组小鼠肺组织HYP水平比较（mg/g）

2.6 3组小鼠肺组织VEGF、CD31表达水平（IOD值）比较见表3。

表3 3组小鼠肺组织VEGF、CD31表达水平（IOD值）比较（×103）

由表3可见，3组小鼠第7、14、28天肺组织VEGF、CD31表达水平比较均有统计学差异（均P＜0.05）；MG组与TG组小鼠第7、14、28天肺组织VEGF、CD31表达水平均高于CG组（均P＜0.05）；TG组小鼠第7、14、28天肺组织VEGF、CD31表达水平均较MG组降低（均P＜0.05）。

3 讨论

ALI的确切发病机制目前尚不明确，临床上也缺乏特异有效的治疗方法，目前对其研究主要集中在致病机制和药物机制方面[11-12]。进一步探索ALI的发病机制，对ALI预防和靶向治疗意义重大。ALI早期消减炎症介质的释放，减轻ALI后的肺纤维化，维持内皮细胞正常功能至关重要[13]。

VEGF可能通过与特异性受体结合促进成纤维细胞生长，合成胶原等细胞外基质，导致肺纤维化[14]。SU5416是一种脂溶性小分子合成受体酪氨酸激酶抑制剂[6]，既可抑制VEGFR-1，也能阻断VEGFR-2。SU5416与VEGFR-1分子结合，能明显抑制单核巨噬细胞在肺部聚集、活化；同时还通过与VEGFR-2结合，降低血管通透性，抑制黏附过程，减少巨噬细胞等炎性细胞的渗出和向损伤病灶的移动[15]，从而减轻ALI后的肺纤维化。HYP是机体胶原蛋白的主要成分之一，为胶原纤维所特有，可以判断纤维化的程度[16]。本研究结果显示，通过LPS诱导小鼠ALI后的第7天，MG组肺血管通透性明显增加，出现肺泡间隔增厚、炎症细胞浸润，伴灶性出血、肺气肿及肺不张等典型ALI改变，后期出现广泛胶原纤维沉积、肺泡腔消失、HYP水平进行性增加等肺纤维化改变，符合ALI后肺纤维化的病理过程。在各时间点MG组和TG组小鼠肺组织HYP水平均明显高于CG组；MG组小鼠肺组织HYP水平呈进行性增加，第28天最高，而在同一时间点TG组较MG组均低。

SU5416通过VEGF/VEGFR信号途径，阻断VEGF对内皮细胞的营养、增殖和促进存活作用，促进内皮细胞凋亡，抑制新生血管形成，减少巨噬细胞等炎性细胞的渗出和向损伤病灶的移动[15]。CD31是新生血管形成的主要标志之一，通过免疫组化法测定CD31表达水平可判断肺组织新生血管的密度，其在调控血管通透性、介导炎性细胞渗入局部组织过程中起关键作用[17]。CD31表达水平上调，是白细胞浸润的分子基础，抑制CD31表达是防治炎性细胞浸润损伤的策略之一。本研究结果显示，TG组小鼠肺组织VEGF、CD31表达水平均较MG组降低，能减轻LPS诱导的小鼠ALI后肺纤维化；其作用机制可能是SU5416抑制VEGF及CD31表达，进而抑制新生血管形成。

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VEGF receptor inhibitor SU5416 attenuates pulmonary fibrosis in mice with acute lung injury

Objective To investigate the effect of VEGF receptor inhibitor SU5416 on pulmonary fibrosis after acute lung injury in rats.MethodsNinety C57BL/6 mice were randomly divided into three groups (n=30 in each group).Lung injury was induced by injection of lipopolysaccharide(LPS)via caudal vein in model group and intervention group;mice in control group were injected with 0.5ml normal saline instead.SU5416 (50mg/kg)was given to mice in intervention group and the same volume of normal saline was given to mice in control group and model group.Mice were sacrificed at d7,d14 and d28.Pathological changes of the lung tissue and ALI score and hydroxyprolline contents were examined.The expression of VEGF and CD31 were measured by immunohistochemistry.ResultsALI score,the expression of VEGF and CD31,and hydroxyprolline contents in model group and intervention group were higher than those in control group.Compared with model group,these changes were attenuated significantly in intervention group.ConclusionAdministration of SU5416 can attenuate LPS-induced pulmonary fibrosis in mice,which is associated with the down-regulation of VEGF and CD31 expression.

Vascular endothelial growth factor receptor inhibitorAcute lung injury Pulmonary fibrosis VEGF CD31