王建明 回陈红 刘昊坤 杜云帆 秦瑄希 牛嗣云

(河北大学医学院组织学胚胎学教研室，河北 保定 071000)

何首乌饮对衰老大鼠生精细胞凋亡的影响

王建明1回陈红 刘昊坤2杜云帆2秦瑄希2牛嗣云

(河北大学医学院组织学胚胎学教研室，河北 保定 071000)

目的 探讨何首乌饮对衰老大鼠睾丸生精细胞凋亡的影响。方法 选用18月龄Wistar大鼠为自然衰老动物模型，以12月龄大鼠作为青年对照，采用原位末端标记法和流氏细胞术分别检测何首乌饮灌胃用药60 d和30 d的18月龄大鼠睾丸组织细胞凋亡率变化和DNA含量的变化。结果 与青年对照组相比，自然衰老组睾丸细胞凋亡率明显增高，单倍体和4倍体细胞明显减少并以二倍体为主，G1/G0期细胞明显增多(P<0.05)，细胞增殖指数明显降低(P<0.05)；而何首乌饮用药后与自然衰老组相比，细胞凋亡率明显降低(P<0.05)；4倍体和单倍体比例明显增加(P<0.05)，与青年对照组无显著性差异(P>0.05)；细胞增殖指数明显升高(P<0.05)，G1/G0期细胞明显减少(P<0.05)。结论 何首乌饮可以抑制生精细胞凋亡，促进细胞增殖，达到延缓睾丸组织衰老的效果，但其具体作用机制有待研究。

何首乌饮；睾丸组织；细胞凋亡；衰老

细胞凋亡在清除发生异常的生精细胞，调节精子的数量和质量方面具有重要作用〔1〕。随着增龄，睾丸组织生精细胞过度凋亡，使精子数量明显减少，异常精子数明显增多〔2〕，其中精原细胞特别是A型精原细胞凋亡是导致精子异常的主要原因〔3〕。目前，关于何首乌饮对睾丸组织细胞凋亡研究报道较少，本研究观察何首乌饮对自然衰老大鼠睾丸组织细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 何首乌饮(SWY)方剂(河北省中医院)，原位末端标记试剂盒(罗氏，美国),细胞周期检测试剂盒和FACS420 型流式细胞仪(Becton Dickinson，美国)，激光共聚焦显微镜(Olympus IX81，日本)，冰冻切片机(Leica，德国)，Eppendorf5424型离心机(Eppendorf，德国)，-80℃冰箱(Thermo，美国)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和取材 选用12月龄的Wistar大鼠适应性饲养1 w后随机分为青年对照组(YC组)、自然衰老组(NA组，灌胃等量的蒸馏水)、SWY1组和SWY2组，每组15只。分别在饲养到16、17月龄后，采用何首乌饮(4.8 g/100 g)，灌胃60 d(SWY1组)、30 d(SWY2组)。去除患肿瘤等疾病的大鼠，最终每组取10只大鼠进入结果分析。大鼠断头处死，取一侧睾丸用4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脱水后，-80℃保存，用于制备冰冻切片；另一侧睾丸组织先放液氮中，几分钟后再放入-80℃保存，用于进行流式检测。

1.2.2 中药复方剂的配制 SWY方剂：由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊霍、丹参、茯苓剪碎按质量比3∶2∶3∶2∶5∶3剪碎混合，加8倍量蒸馏水浸泡1 h，然后文火水煎2次，每次30 min，过滤后浓缩至含生药分别为4.8 g/ml，4℃ 保存，给药前复温至25℃～30℃。给药量：按照成人剂量换算，SWY熬制后含生药2.4 g/100 g相当于成人用药量，根据前期研究结果选用成人量2倍疗效最佳，因而采用含生药4.8 g/100 g作为给药浓度。0.4 ml/100 g灌胃，每天15∶00灌胃1次，连续灌胃60 d或30 d。

1.2.3 原位末端标记法检测睾丸组织细胞凋亡率 冰冻切片平衡至室温，PBS洗涤3次，每次10 min；0.5% TritonX-100室温通透20 min；PBS洗涤3次，每次10 min；每个切片加约30 μl Equilibration Buffer室温反应10 min；加入染色工作液，37℃避光孵育1 h；加入2倍SCC室温反应15 min；PBS洗涤3次，每次10 min；DAPI室温染核20 min,PBS洗涤3次，每次10 min；待片子晾干后用专用荧光封片剂封片，激光共聚焦显微镜观察拍照。每组选取3只大鼠的一侧睾丸组织进行切片，每张切片随机选取10个高倍视野(×400)，计数500个细胞中的阳性细胞数，求得阳性细胞率。

1.2.4 流式细胞术检测生精细胞中DNA含量 取冰冻组织适量，42℃复温，去除白膜和脂肪垫，放于培养皿中。向培养皿加入1 ml PBS，用剪刀剪碎，将悬液转入组织破碎仪的加样槽内破碎1 min。用5 ml注射器从吸样孔内吸出细胞悬液，4 000 r/min离心10 min，弃上清。向细胞沉淀中加入1 ml 70%冰乙醇，用移液枪轻轻吹打混匀，4℃固定过夜。取出细胞悬液，4 000 r/min，离心8 min，弃乙醇上清；加入1 ml PBS重悬，4 000 r/min，离心8 min，弃上清，重复2次。向沉淀中加入500 μl PI染色液，4℃下放置30 min，过200目滤网。应用FACS420 型流式细胞仪进行定量分析，数据输入Consort-30计算机进行处理。细胞的增殖活性以增殖指数(PI)表示,其计算公式为:PI(%)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+S2/M)×100%。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0软件，符合正态分布的数据均数比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA)；若方差齐，两两比较采用最小显著差法(LSD)，如果方差不齐则采用DunnettT3检验。

2 结 果

2.1 何首乌饮对细胞凋亡的影响 YC组大鼠睾丸组织细胞凋亡较少见，主要分布在间质细胞。NA组大鼠睾丸组织生精小管内可见大量凋亡的生精细胞且凋亡阳性信号主要分布于精原细胞、精母细胞和精子细胞，偶见于间质细胞。SWY组大鼠的睾丸组织凋亡细胞明显减少，可见部分精原细胞和间质细胞发生凋亡。半定量分析显示，NA组大鼠细胞凋亡率〔(14.606 7±0.092 8)%〕明显高于YC组〔(1.946 7±0.440 1)%〕(P<0.01)；SWY组细胞凋亡率明显低于NA组(P<0.01),且SWY1组细胞凋亡率〔(8.008 9±0.164 3)%〕明显低于SWY2组〔(12.959 3±0.317 4)%〕。见图1。

2.2 何首乌饮对生精细胞周期的影响 图2所见，YC组睾丸生精细胞以单倍体为主，包括圆形精子以及精子；NA组单倍体和4倍体细胞明显减少，以二倍体为主；与NA组相比，SWY饮组4倍体和单倍体比例明显增加(P<0.05)，且与YC组无显著性差异(P>0.05)。细胞周期结果显示，与YC组相比，NA组可引起G1/G0期细胞明显增多(P<0.05)，PI明显降低(P<0.05)；SWY用药后，PI明显升高(P<0.05)，G1/G0期细胞明显减少(P<0.05)，且SWY1组PI明显高于SWY 2组。见表2。

图1 SWY对各组睾丸细胞凋亡的影响

图2 SWY对大鼠睾丸组织各种倍体细胞所占百分比的影响

组别G1/G0(%)S(%)G2/M(%)PIYC组5064±3422772±3621901±3845205±342NA组8102±4471)892±1471)1006±3361)1898±4471)SWY组6265±1792)1966±5132)1748±4652)3733±1792)

与YC组比较：1)P<0.05；与NA组比较：2)P<0.05

3 讨 论

现代研究证实，何首乌具有提高机体免疫力，降血脂，抗动脉粥样硬化和神经保护作用，具有明显的抗衰老效果〔4〕。何首乌丸是刘河间《宣明论》的传统临床验方，以何首乌为主药，配以肉苁蓉和怀牛膝临床疗效可靠。SWY是由何首乌丸加味而成，其中淫羊藿补肾壮阳以强筋骨，丹参活血化瘀以通心脉，茯苓健脾利湿以宁心神。目前研究结果表明，SWY能提高D-半乳糖所致衰老大鼠的抗氧化能力、改善血脂紊乱状态，调节性腺细胞衰老通路 p53/pRb 相关蛋白表达〔5,6〕。我们前期研究发现SWY饮能够提高睾丸间质细胞睾酮合成酶表达，促进睾酮的分泌，提高自然衰老大鼠精子质量〔7〕。SWY可以上调过度训练大鼠睾丸间质细胞中的 Bcl-2 蛋白表达，下调 Bax 蛋白表达，从而抑制睾丸间质细胞的凋亡，减轻过度训练对大鼠睾丸间质细胞的损伤〔8〕。

衰老将导致雄性哺乳动物精子生成能力减弱，生精细胞凋亡增加〔2〕，随着年龄增加，老年小鼠睾丸中部分曲精细管萎缩、基膜增厚，生精阻滞常见于初级精母细胞或精子细胞阶段〔9〕；减少最明显的就是球形精子或延长精子细胞〔10〕，这说明衰老小鼠生精功能改变最先发生在精子发生的后期。Syed 等〔11〕指出老年小鼠支持细胞诱导能力的丢失也是导致生精细胞凋亡的重要原因。细胞凋亡由多位点调控，可以发生在细胞周期的各个阶段，常见的有G0/G1期停滞和G2/M期阻滞〔12～14〕。本实验结果显示，SWY能明显降低自然衰老大鼠睾丸细胞凋亡率，提高细胞增殖指数，证明SWY能抑制衰老大鼠生精细胞凋亡，促进细胞增殖，但此种作用机制尚不清楚，有待进一步研究。

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〔2016-10-25修回〕

(编辑 郭 菁)

The effects of Heshouwuyin on germ cell apoptosis in natural aging rats

WANG Jian-Ming,HUI Chen-Hong,LIU Hao-Kun,etal.

Department of Tissue and Embryo,School of Medicine,Hebei University,Baoding 071000,Hebei,China

Objective To investigate the effects of Heshouwuyin on testicular germ cells apoptosis in natural aging rats.Methods 18-month-old Wistar rats were served as a model of natural aging and 12-month-old rats were as a young control group.Heshouwuyin group 1 and group 2 were given Heshouwuyin intragastrically for 60 days and 30 days respectively.In situ end labeling and flow cytometry methods were selected to detect the rate of apoptosis detection and the amount of DNA in testicular cells.Results The rate of testicular cell apoptosis was obviously higher in natural aging group and that intervention with Heshouwuyin reversed this phenomenon(P<0.05).The spermatogenic cells in natural aging group were mainly diploid and the numbers of haploid and tetraploid were significantly lower,but the rate of haploid and tetraploid was significantly higher in Heshouwuyin group than that in nature aging group(P<0.05).Compared with that of young control group，the number of cells in G1/G0cycle arrest was significantly higher in natural aging group (P<0.05),and the cell proliferation index was significantly lower in natural aging group (P<0.05).Heshouwuyin administration reversed this phenomenon.Conclusions Heshouwuyin could inhibit testicular cells apoptosis,promote cell proliferation,reach the effects of anti-aging,but its mechanism of action remains to be further researched.

Heshouwuyin; Testis tissue; Cell apoptosis; Aging

国家自然科学基金面上项目(81373787)；河北省自然科学基金面上项目(H2013201139)

牛嗣云(1967-)，女，教授，博士，硕士生导师，主要从事生殖药理学的研究。

王建明(1969-)，男，副教授，主要从事生殖药理学的研究。

R34

A

1005-9202(2017)02-0266-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.003

1 河北民族师范学院 2 中国人民解放军军事交通学院九连