刘庆生 邱 静 蔡丹莉 桑 怡 陈芝芸

我国是胃癌高发地区，其病死率居于各种恶性肿瘤的首位，慢性萎缩性胃炎（CAG）的胃黏膜肠上皮化生和异型增生被广泛认为是胃癌前病变，CAG伴肠腺化生或不典型增生的癌变率为7%～9%。研究发现，胃黏膜组织存在腺体萎缩和慢性炎症时，该部位黏膜细胞抑癌基因启动子区域呈高甲基化状态和抑癌基因蛋白的低表达。目前关于CAG不同中医证型与胃癌关系研究报道较少，然而文献报道CAG的产生与胃黏膜组织中P16、hMLH1基因的表达有关［1］。因此本研究以P16、 hMLH1 DNA甲基化表达为切入点，采用焦磷酸测序法检测经病理组织学证实的CAG患者胃黏膜中的P16、hMLH1 DNA甲基化表达。分析CAG不同中医证型胃黏膜p16、hMLH1 DNA甲基化水平差异及其相关性，探讨癌基因侵袭、发生、发展与中医证型之间的关系，寻求这些差异产生的可能原因。

1 材料与方法

1.1 一般资料 2013年1月至2014年12月就诊于本院经电子胃镜以及胃黏膜组织病理证实为CAG的患者180例［2］，辨证分型为肝胃不和型、瘀毒内阻型、痰湿凝结型、脾胃虚寒型、胃热伤阴型、气血双亏型［3］，每组各30例。其中男86例，女94例；年龄30～75岁，平均年龄（62.98±10.06）岁。再每组选取无嗜酒史、无服药史的患者12例，共72例CAG患者检测胃黏膜DNA甲基化率，其中男32例，女40例；年龄30～75岁，平均年龄（60.94±11.14）岁。各证型间年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经院伦理委员会审查通过。

1.2 病例纳入与排除标准 纳入标准：（1）符合CAG诊断标准的患者（男女不限）［3］。（2）年龄 18～75 岁。（3）近4周未服用过质子泵抑制剂及抗生素。（4）自愿参加研究并签署知情同意书。排除标准：（1）有胃部手术史者。（2）已确诊为胃癌或者其他系统恶性肿瘤患者。（3）长期服用非甾体抗炎药（NSAID）患者。

1.3 实验材料及方法 （1）标本采集：常规胃镜检查，取胃窦、胃角和胃体胃黏膜进行病理组织活检，新鲜标本立即放置于EP管中，迅速保存至液氮中。（2）方法：检测胃黏膜组织p16、mlh1DNA甲基化表达，严格按照试剂盒说明操作。Pyrosequencing检测在96孔PCR反应板中加入反应结合珠2μl，结合缓冲液38μl，PCR产物40μl，室温下充分混匀10min。开启真空泵吸取结合珠及PCR产物混悬液，依次浸入70% 乙醇，0.2M NaOH和冲洗缓冲液中各5s；关闭真空泵，后将探头上结合珠及PCR产物置人40μl退火缓冲液（含测序引物1.5μl），85℃变性2min，冷却至室温，使引物与模板退火杂交。根据Pyrose quencing软件序列设计信息计算出剂量，在试剂舱中依次加入底物混合物、酶混合物及四种dNTP（QIAGEN），将试剂舱及96孔反应板放入Pyrosequencing检测仪（PyroMark Q96 ID，QIAGEN）进行反应，Pyro Q-CpG软件自动分析取得各位点甲基化定量分析数据。引物合成见表1。

表1 引物合成

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0统计软件。计量资料以（s）表示，行正态性检验和方差齐性检验，服从正态分布的采用多组均数比较的单因素方差分析，若不服从正态分布，采用非参数检验法；计数资料以n表示，行非参数检验法Kruskal Wallis检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中医各证型间性别和年龄的比较 CAG中医各证型间性别和年龄比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2、3。

表2 中医各证型间性别的比较（n）

表3 中医各证型间年龄的比较［岁，］

表3 中医各证型间年龄的比较［岁，］

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2.2 p16，hMLH1DNA基因甲基化与CAG中医各证型关系 CAG的中医各证型中p16基因甲基化率由高至低依次是肝胃不和＞脾胃虚寒＞气血双亏＞痰湿凝结＞胃热伤阴＞瘀毒内阻。组间两两比较发现，胃热伤阴、瘀毒内阻组与肝胃不和组比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表 4。

表4 p16基因甲基化与CAG中医各证型关系

2.3 基因甲基化与CAG中医各证型关系 见表5。

表5 hMLH1DNA基因甲基化与CAG中医各证型的关系

2.4 P16、hMLH1 DNA甲基化与病理分级关系 经Spearman相关法检验，发现CAG中医各证型DNA甲基化与病理分级比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.5 P16、hMLH1 DNA 甲 基 化 与 Hp关 系 经Spearman相关性检验，发现CAG中医各证型DNA甲基化与Hp感染比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

研究认为幽门螺旋杆菌（Hp）感染是触发CAG形成和导致胃癌的重要危险因素，根除Hp可以延缓胃黏膜萎缩的进展，降低胃癌发生的危险性。KondoT等［4］在研究与胃MALT淋巴瘤发现，相关的11个基因的CpG岛甲基化表型发生率与Hp感染率同步上升，其中尤其是p16，MINT31等基因的甲基化与Hp感染密切相关。另有研究发现，CAG癌前病变的病理变化与中医证型之间存在一定的相关性，病理程度较轻时以实证为主，病理程度中、重度时以虚为主，虚实夹杂表现多见［5］。本研究经Spearman相关性检验，发现CAG中医各证型p16及hMLH1DNA甲基化与病理分级比较差异无统计学意义（P＞0.05）。可能受近年来患者健康意识、胃镜普查率的提高等因素影响，入组的病例以单纯CAG伴轻度肠化患者居多，而中重度肠化及不典型增生病例相对太少有关。

DNA甲基化是最为重要的表观遗传学修饰，其热点是启动子区CpG岛的高甲基化导致的抑癌基因表达失活和及低甲基化导致的原癌基因的激活。CpG岛在正常状态下一般是非甲基化的，当其发生甲基化时，常使重要的基因如抑癌基因、DNA修复基因、凋亡基因等发生转录沉寂，导致正常细胞的调控失常以及DNA损伤不能被及时修复，形成肿瘤。

抑癌基因启动子区CpG 岛的异常甲基化导致其功能失活是其参与肿瘤发生的重要机制之一。p16基因被认为是最重要的抑癌基因之一，其编码的p16蛋白可通过与细胞周期蛋白依赖激酶 CDK4和CDK6 结合而抑制蛋白激酶的活性，从而对细胞周期起到负调控作用。与其他肿瘤不同的是，在胃癌中p16基因突变或缺失少见，而主要由于启动子和第1外显子甲基化导致。在正常细胞中p16基因启动子区保持非甲基化状态，基因可以正常表达、转录，基因启动子甲基化可诱导p16、CDX2及 RASSF1A等抑癌基因的失活［7-9］。Yao等［6］研究显示，21例由胃黏膜上皮异型增生发展为胃癌的病例中，有5例检测到p16基因异常甲基化，并经基因测序证实该基因启动子区域CpG岛出现高甲基化，反映了癌的演变过程，也证明了其可能是早期事件。本实验结果发现，各证型中p16基因甲基化率由高至低依次是肝胃不和＞脾胃虚寒＞气血双亏＞痰湿凝结＞胃热伤阴＞瘀毒内阻。组间比较发现，胃热伤阴、瘀毒内阻组与肝胃不和组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。而肝胃不和、脾胃虚寒、气血双亏组p16基因甲基化率较痰湿凝结、胃热伤阴及瘀毒内阻高，且组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

hMLH1作为主要的DNA错配修复基因之一，表达减少或缺失都会削弱DNA错配修复的能力。Li等［7］研究191例胃癌组织、133例癌旁组织和42例非胃癌患者正常胃黏膜组织，发现其hMLH1表达分别为80.1%（153/191）、60.2%（80/133）和31.0%（13/42），癌组织hMLH1表达明显高于癌旁组织和非胃癌患者的正常胃。由此得出，hMLH1基因启动子区CpG岛的异常甲基化是引起蛋白表达缺失的主要原因，hMLH1蛋白表达缺失与胃癌的发生有关。本研究经非参数检验，发现CAG的中医各证型中hMLH1 DNA基因甲基化率比较差异无统计学意义（P＞0.05），提示hMLH1 DNA基因甲基化率与CAG中医各证型无相关性。

本资料结果显示，各证型中痰湿凝结、胃热伤阴、瘀毒内阻型p16基因甲基化率较其他三型低，p16为抑癌基因，基因启动子甲基化率降低可抑制抑癌基因的失活，因此，上述结果提示此三型CAG的人群癌变发生率可能低于其他三型。而肝胃不和、气血双亏、脾胃虚寒型p16基因甲基化率较其他三型高，提示这三型CAG的人群癌变发生率可能会增加，因此，在治疗方面，对于肝胃不和、气血双亏、脾胃虚寒型的CAG应高度重视，定期随访，及早治疗防止胃癌的发生。CAG萎缩部位与胃癌的发生率密切相关，已知的胃体萎缩癌变率高于胃窦，CAG不同部位萎缩的癌变率是否与上述中医证型相关，有待进一步研究。

［1］ 刘丽华,张方信．胃癌前病变中DNA甲基化状态与叶酸．世界华人消化杂志,2005,13(23):2770-2772．

［2］ 刘庆生,桑怡,蔡丹莉,等．慢性萎缩性胃炎中医证型与病理﹑HP感染关系研究．浙江临床医学杂志,2015,17(12):2121-2123．

［3］ 郑筱萸．中药新药临床研究指导原则．中国医药科技出版社,2002:124-128．

［4］ T Kondo,T Oka,H Sato,et al． Accumulation of aberrant CpG hypermethylation by Helicobacter pylori infection promotes development and progression of gastric MALT lymphoma．Int JOncol,2009, 35(3):547-557．

［5］ 王俊,黄雅慧．CAG胃黏膜癌前病变病理变化与中医证型及TRPV1﹑TRPM8的相关性研究．现代中西医结合杂志,2014,23(24):2627-2630．

［6］ Yao JF,Chen WX,Yin YL,et al．Expressions and clinical significance of cyclo oxygenase-2 and p16 in gastric cancer and its precancerous lesion．Chin J Gastroentero,2009,14(1):31-34．

［7］ Li M,Liu L,Wang Z, et al． Overexpression of hMSH2 and hMLH1 protein incertain gastric cancers and their surrounding mucosae．Oncol Rep,2008,19(2):401-406．