冯晓红 黄 琦* 金若晨 陈 颉

糖尿病慢性并发症的发生发展不仅与整体血糖水平有关，而且与血糖的波动性也密切相关。波动性高血糖导致糖尿病慢性并发症机制尚不明确，有研究显示可能与血糖波动产生氧化应激有关。波动性高血糖比持续性高血糖产生更明显的氧化应激［1］。Nrf2/ARE信号通路是重要的内源性抗氧化应激通路［2］。Nrf2是调节细胞抗氧化应激的重要转录因子，HO-1、γ-GCS，是受其调控的下游抗氧化蛋白。本实验拟观察波动性高血糖糖尿病大鼠肾脏HO-1、γ-GCS及 Nrf2表达的影响，探讨波动性高血糖危害的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲养条件 健康雄性SPF级SD大鼠24只，体重160～180g，鼠龄6～8周，由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供。温度（20±2）℃，相对湿度50%～60%，光照12 h明暗交替，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心。

1.2 实验材料 超短效胰岛素诺和锐（丹麦诺和诺德）；链脲佐菌素（购自美国Sigma公司）；血糖试纸及血糖仪（德国罗氏）；自制高脂饲料：蔗糖10%、蛋黄10%、猪油10%、胆固醇0.5%、基础饲料69.5%；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、活性氧簇（ROS）试剂盒；HO-1、γ-GCS及Nrf2蛋白一抗（购自美国Abcam公司）。

1.3 模型建立 将24只雄性SD大鼠随机分成正常对照组（N组，n=8）和糖尿病模型组（n=16）。普通饲料喂养组，高脂饲料喂养糖尿病模型组大鼠组。2周后模型组予小剂量链脲佐菌素（STZ）35mg/kg腹腔注射诱导建立糖尿病大鼠模型，造模1周后，测随机血糖≥16.7mmol/L为模型制作成功。将糖尿病模型组随机分为稳定高糖组（S组，n=8）和波动性高糖组（F组，n=8），F组注射葡萄糖、胰岛素制备血糖波动大鼠模型，N组及S组给予腹腔注射生理盐水0.375 g/（kg·d）体重作为对照。F组每日8：00及15：00给予腹腔注射250g/L葡萄糖溶液0.375g/（kg·d），并分别于30 min后给予腹腔注射超短效胰岛素类似物诺和锐1U，造成1d中血糖值大幅度波动。喂养8周。

1.4 标本采集及指标测定 实验结束后所有大鼠予10%水合氯醛1ml/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，离心取上清液，测定SOD、MDA、ROS值（方法参照说明书）；处死大鼠后取肾脏组织，以10%中性甲醛液固定。HE染色，常规脱水、石蜡包埋、切片。免疫组化测定HO-1、γ-GCS及 Nrf2的表达。PV法免疫组化染色，严格按照PV试剂盒说明书操作，DAB显色，阳性颗粒呈棕黄色。应用数码医学图像分析系统进行免疫组化染色分析，测定HO-1、γ-GCS及 Nrf2阳性表达的平均光密度（OD值）。每个切片随机测定5个视野的阳性OD值，取平均值作为该片的代表值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 造模后S组大鼠精神萎靡，行动迟缓，对外界反应迟钝，毛色无光泽，易脏，进食减少，饮水量、尿量增加，尿液腥臊味加重，多数大鼠体质量明显降低，F组较S组症状更明显。

2.2 造模第4周大鼠血糖比较 见表1。

表1 造模第4周大鼠血糖比较［mmol/L，］

表1 造模第4周大鼠血糖比较［mmol/L，］

注：与N组比较，*P＜0.05

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2.3 各组大鼠血清指标结果的比较 见表2。

表2 各组大鼠血清指标结果的比较

表2 各组大鼠血清指标结果的比较

注：与N组比较，*P＜0.05；与S组比较，#P＜0.05

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2.4 肾脏HE染色 N组肾小球及肾小管结构未见明显病变，S组肾小球细胞轻度增多，体积增大；F组肾小球毛细血管球萎缩，球囊增大，分叶明显，肾小管结构紊乱。

2.5 大鼠肾脏组织HO-1、γ-GCS及 Nrf2表达的比较 HO-1阳性表达肾小球胞浆，γ-GCS阳性表达主要分布于肾小球固有细胞、肾小管上皮细胞的胞浆中，Nrf2蛋白阳性表达定位于肾小球固有细胞的胞浆和胞核，阳性表达呈棕黄色颗粒。见表3、图1～3。

表3 大鼠肾脏组织HO-1、γ-GCS及 Nrf2表达的比较（

表3 大鼠肾脏组织HO-1、γ-GCS及 Nrf2表达的比较（

注：与N组比较，*P＜0.05；与S组比较，#P＜0.05

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图1 各组HO-1免疫组化染色情况

图2 各组γ-GCS免疫组化染色情况

图3 各组Nrf2免疫组化染色情况

3 讨论

糖尿病的高血糖状态可以分为慢性持续性高血糖和慢性波动性高血糖两种。慢性持续高血糖和波动性高血糖对糖尿病的预后及慢性并发症的发生和发展密切相关［3］，而且糖尿病患者血糖波动越大，慢性并发症的发生率越高，预后越差。最近发现糖尿病发生的急性血糖波动是触发氧化应激反应的一个额外因素［4］，即血糖波动更容易引发氧化应激［5］。氧化应激在糖尿病及其并发症的发生发展过程中有着重要的作用。

氧化应激是指机体组织或细胞内氧自由基生成增加和（或）消除能力降低，导致活性氧（ROS）家族在机体内或细胞内蓄积而引起的氧化损伤。高血糖状态下，长期的代谢失衡生成大量的ROS，可以通过激活多元醇通路、蛋白激酶C（PKC）、糖基化终末产物（AGEs）及氨基己糖等多种途径和直接作用引起血管内皮损伤，导致血管病变产生并发症。其中过氧化的脂质降解后的产物MDA（丙二醛）可间接反映氧自由基对血管细胞的损伤程度。

氧化应激状态下，机体内抗氧化防御体系被激活，有一种重要的抗氧化酶SOD，其具有催化超氧阴离子自由基发生歧化反应的性质，可清除超氧阴离子自由基，防止细胞损伤，故可反映机体的抗氧化能力。另外氧化应激状态下，Nrf2 通过与抗氧化酶/蛋白基因上游中的抗氧化反应元件（ARE）相互作用调节编码抗氧化蛋白，是迄今发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路。在氧化应激的状态下，Nrf2和其细胞质接头蛋白Keap1发生分离，前者会向细胞核中转运和活化，启动其下游多种抗氧化蛋白表达和Ⅱ相解毒酶的合成，如HO-1、γ-GCS，SOD等，减轻氧化应激引起的损伤。波动性高糖对内皮细胞产生严重的氧化应激损伤情况下，HO-1作为一种重要的细胞保护蛋白其表达相应地增高，但生理性的代偿并不足以拮抗氧化应激所带来的细胞损伤。研究表明，诱导HO-1增加在抗氧化、抗高血压、糖尿病和缺血再灌注肾保护中有积极作用［6］。γ-GCS 是抗氧化剂的重要屏障-谷胱甘肽合成过程中的限速酶，分为重链（γ-GCSHS）和轻链（γ-GCS-LS）两个亚基，其数量、活性等直接影响抗氧化的水平。

本实验发现，无论是稳定性高血糖还是波动性高糖，均可导致SOD活力下降、MDA、ROS含量增加，大鼠肾脏HO-1，γ-GCS及Nrf2的表达均较正常组有所增加，相对于稳定性高糖，波动性高糖使上述变化更为显著，说明波动性高糖可使氧化-抗氧化失衡进一步加剧，氧化应激损伤加重。Nrf2可能是糖尿病肾病发病中抗氧化基因表达的关键转录调控因子，其转录调控的下游抗氧化蛋白H0-1和γ-GCS参与了糖尿病肾病的抗氧化防御机制。

［1］ Ceriello A,Esposito K,Piconi L,et al．Oscillating glucose is more deleterious to endothelial function and oxidative stress than mean glucose in normal and type 2 diabetic patiens．Diabetes, 2008,57(5):1349-1354．

［2］ Kensler TW,Wakabayashi N,Biswal S．Cell survival responses to environmental stresses via the Keap1－Nrf2－ARE pathway．Annu Rev Pharmacol Toxicol,2007,47(1): 89-116．

［3］ 王先令,陆菊明．血糖波动对糖尿病预后及其慢性并发症发生发展的影响．国外医学:内分泌学分册,2005,25(3):169-171．

［4］ Yaqoob M,McCMland P,Patrick AW,et al．Evidence of oxidant injury and tubular damage in early diabetic nephropathy．QJM,1994, 87(10):601-607．

［5］ 李金荣,王瑞英,张松筠．NADPH氧化酶在糖尿病肾病中的作用．国际内科学杂志,2009,36(2):93-97．

［6］ Cao J,Sodhi K,Inoue K,et al．Lentiviral-human heme oxygenase targeting endothelium improved vascular function in angiotensin II animal model of hypertension．Hum Gene Ther,2011,22(3):271-282．