魏志豪，孙远梅，李 博，王 曾，张开林，王培荣，朱晨光，蒲晓辉，袁 琦

河南大学 药物研究所，河南 开封 475004

肿瘤细胞的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药性后，对其他多种化疗药物也产生不同程度的耐药性，致使药物的疗效不断下降。MDR造成抗肿瘤药物治疗效果更加不尽人意，以至于治疗失败甚至导致患者死亡[1]，是临床上导致肿瘤化疗失败的主要原因之一。因此，寻找高效低毒的MDR逆转技术对改善肿瘤的化疗效果显得至关重要。

聚乙二醇单甲醚属于醚类，相比于聚乙二醇，聚乙二醇单甲醚性质更加稳定，毒性也明显降低，对人体伤害较小。且其在化学合成中容易进行化学修饰，因此被广泛应用于材料合成以及制剂当中[2]。去氧胆酸(DCA)是一种生物表面活性剂[3]，且作为肝脏合成的一种天然化合物具有良好的生物相容性；去氧胆酸在国际上公认是一种生物相容性很好而广泛应用于纳米制剂的稳定剂，而且研究表明[4]对纳米粒子具有长循环作用，它本身也具有抗红细胞聚集等作用。

我们以乙酰化鹅去氧胆酸为疏水部分，聚乙二醇单甲醚为亲水部分，设计、合成了生物相容性好、生物可降解的两亲性高分子聚合物材料(mPEG-CDCA)，通过核磁共振、红外光谱等表征手段确定了结构，运用荧光探针法测得临界胶束浓度(CMC)，结果显示，聚乙二醇单甲醚-鹅去氧胆酸聚合物作为胶束载药系统的载体具有很大的潜力及应用前景。此后，我们将进一步对其制剂学性质及抗肿瘤多药耐药作用进行研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AVATAR360型傅立叶变换红外光谱仪(美国)；AVANCE 400核磁共振谱仪(瑞士)；F7000荧光分光光度计(日本)。

聚乙二醇单甲醚(mPEG，天津市科密欧化学试剂有限公司)；二氯甲烷(CH2Cl2，天津市科盟化工工贸有限公司)；丙酮(CH3COCH3，天津市富宇精细化工有限公司)；盐酸(HCl，中国平煤神马集团开封东大化工有限公司)；无水乙醚(Et2O，天津德恩化学试剂有限公司)；无水碳酸钠(Na2CO3，天津德恩化学试剂有限公司)； N，N-二甲基甲酰胺(DMF，天津基准化学试剂有限公司)；N-羟基丁二酰亚胺；N, N-二环己基碳酰亚胺(C13H22N2，国药集团化学试剂有限公司)；乙酸酐(AC2O，天津市富宇精细化工有限公司)；鹅去氧胆酸(CDCA，C24H40O4，安徽天启化工科技有限公司)。

1.2 聚乙二醇单甲醚-乙酰化鹅去氧胆酸的合成

聚乙二醇单甲醚-乙酰化鹅去氧胆酸的合成如图1所示，具体操作如下：将11 mmoL CDCA与3.3 mmoL DMAP溶解于装有100 mL四氢呋喃烧瓶中，在室温下搅拌30 min使其完全溶解，转速为400 r/min，然后逐滴加入乙酸酐(AC2O)50 mmoL，在70 ℃下加热回流反应6 h。反应结束后减压浓缩。后加入适量的乙酸乙酯使其完全溶解，用蒸馏水进行萃取直至酸味消失，然后用饱和NaCl继续萃取2次，取上层乙酸乙酯倒入烧瓶中加入无水硫酸镁，摇匀，静置2 h。过滤，旋蒸至固体。为白色粉末。薄层色谱分析Rf为0.47，展开剂为(正己烷与乙酸乙酯的质量比为10∶3)，用柱色谱法进行纯化产品，洗脱剂为(正己烷与乙酸乙酯的质量比为20∶1)，接收洗脱液旋蒸得到白色精制产品。

将乙酰化鹅去氧胆酸3.75 mmoL与聚乙二醇单甲醚1.37 mmoL溶解于100 ml的无水二氯甲烷 (CH2Cl2) 中，再在冰浴下加入DMAP 3.75 mmoL与DCC 3.75 mmoL，待全部溶解完毕后，室温下通入氮气保护反应48 h。反应完毕后加入饱和NaHCO3溶液萃取3次，再用饱和NaCl溶液萃取3次。取出有机层进行薄层分析Rf=0.5(二氯甲烷、甲醇、醋酸的体积比为10∶1∶0.05)，运用柱分离纯化产品，洗脱剂为(二氯甲烷、甲醇、醋酸的体积比为20∶1∶0.05)，接收的洗脱液旋蒸干燥后得到白色产品。

1.3 结构表征

采用KBr压片法，用AVATAR 360型傅立叶变换红外光谱仪测定红外光谱；用AVANCE 400型核磁共振谱仪测定各样品的氢谱，溶剂为CDCl3或DMSO，内标为TMS，温度25 ℃。

1.4 临界胶束浓度(CMC)测定

称量10 mg的聚合物置于20 mL西林瓶中，瓶中各加10 mL DMF，然后取10mLDMF溶液放入透析袋(透析袋截留量1.5 KD)，在1L烧杯中透析48 h，透析介质为蒸馏水，透析过程中每隔4 h更换一次蒸馏水每次更换量为1 L。透析完成后聚合物溶液以3 000 r/min离心30 min，并用0.45 μm的滤膜过滤得到略带蓝色乳光的胶束溶液，将其用蒸馏水稀释成不同浓度，分别加入到盛有预先配好的芘-丙酮溶液的棕色瓶中(芘的最终浓度5×10-7mol/L)，超声15 min，并在37 ℃和转速为120 r/min下恒温振荡器中孵育24 h，用荧光分光光度计进行测定。激发波长335 nm，发射波长为373 nm和383 nm。

图1 聚乙二醇单甲醚-鹅去氧胆酸的合成

2 结果与分析

2.1 核磁共振

为了证实是否获得每一步合成的目标产物，我们分别对上文两步合成所得产物和mPEG原料进行了NMR氢谱分析，结果分别见图2。

a：乙酰化鹅去氧胆酸的NMR图；b：聚乙二醇单甲醚的核磁共振图；c：PEG-CDCA的核磁共振图。图2 聚乙二醇单甲醚-鹅去氧胆酸的核磁共振图

由图2a可知，0.91(s,3H,CH3)、0.94(d,3H,CH3,J =6.45)、0.99(s,3H,CH3)为CDCA环上的甲基质子峰, 1.10～2.39(m,28H)为CDCA的四个六元环的亚甲基质子峰，0.6(s,3H)为CDCA侧链18位上的甲基质子峰，11.97(s,H)为CDCA的羧基质子峰，且在2.01 ppm和2.04 ppm处出现新的信号峰则为乙酰基。结果显示表明乙酸酐对CDCA的乙酰化成功。由图2b可以明显看出，3.47～3.83 ppm为(-CH2CH2O-)重复单元的位置。由图2c可看出，在0.91、0.94、0.97 ppm的位置上为乙酰化鹅去氧胆酸环的3个甲基信号峰，且在2.01ppm和2.04ppm处是乙酰基的2个峰，CDCA上的各峰的化学位移没有明显变化，在3.54～3.84 ppm表示的是聚乙二醇单甲醚中(-CH2CH2O-)信号峰，且在11.97(s,H)的羧基质子峰消失。果表明乙酰化的CDCA通过酯化反应链接上聚乙二醇单甲醚。

2.2 傅里叶红外光谱

通过分析图3可以得出，如下结构信息：在乙酰化胆酸中，在2 941.48 cm-1、2 867.3 cm-1为乙酰化鹅去氧胆酸中亚甲基与甲基的VC-H的伸缩振动峰；1 731.24 cm-1乙酰化鹅去氧胆酸中羧基的C=O伸缩振动峰；1 245.32 cm-1为乙酰化鹅去氧胆酸的C-O-C的伸缩振动峰，说明成功合成了乙酰化鹅去氧胆酸。在mPEG中，1 116.89 cm-1为聚乙二醇单甲醚中C-O的伸缩振动峰；2 878.48 cm-1为聚乙二醇单甲醚的甲基的C-H的伸缩振动峰。在mPEG-CDCA中， 1 731.24 cm-1处出现了酯的C=O伸缩振动峰且在1 116.89 cm-1处出现了聚乙二醇单甲醚的C-O-C的伸缩振动峰，因此以上信息也佐证了mPEG-CDCA的成功合成。

图3 乙酰化胆酸、mPEG、mPEG-DCA的红外图谱

2.3 临界胶束浓度浓度的测定

临界胶束浓度是表面活性剂和两亲性聚合物最基本的重要参数，是表面活性剂和两亲性聚合物形成胶束所需浓度的一种量度，它的大小反映了表面活性剂和两亲性聚合物形成胶束的能力。临界胶束浓度的测定方法有多种，本文运用的是芘荧光探针法。芘荧光探针法主要原理是利用胶束对芘增溶作用来实现的。有文献报道，芘在不同波长下荧光强度与其所处的环境极性有关，通常两亲性共聚物在水溶液中形成胶束的过程中，芘会被胶束所包裹，从而使其所处环境的极性发生变化，导致芘荧光光谱中I383/I373的比值发生突变[5]。因此，我们选择荧光探针法测定mPEG-DCA的CMC值，其测定曲线如图4所示。

从图4可以看出，在较低浓度时I383/I373值趋于平稳，变化不大；随着聚合物浓度的增大，I383/I373值发生了突变，此时聚合物的浓度达到了形成胶束的临界值，即此时对应的浓度就是临界胶束浓度。通过测定，得出mPEG-CDCA的CMC值为17.3×10-3mg/L，由此来看，其CMC远低于常见的其他两亲性聚合物[6]，其胶束的成型性可能较好。因此，我们推断，本文合成的mPEG-CDCA两亲性聚合物形成的胶束可能具有良好的稀释稳定性[7]。

图4 mPEG-CDCA的临界胶束浓度图

3 讨论

为了促进反应更好的进行，文中采用4-二甲氨基吡啶(DMAP)和N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)作为催化剂和脱水剂。DMAP能够活化羧基，使其生成中间体，而DCC除做为脱水剂生成DCU之外也可作为催化剂使用，两者合用共同促进反应向生成产物的方向进行。

聚合物材料的纯度是影响制剂学研究的关键因素，为得到较为纯净的产物，文中采用蒸馏水对反应液进行萃取，目的是除去部分DMAP及乙酸酐(遇水生成醋酸)。而反应中所用的饱和碳酸氢钠是用于除去多余的乙酰化鹅去氧胆酸。然后反应产物用柱层析法提纯，通过调试不同的洗脱液比例，最终确定二氯甲烷、甲醇、醋酸的最佳比例为20∶1∶0.05。以此比例进行柱层析得到的终产物纯度最高。最后对其进行核磁与红外表征，确定终产物是否成功合成。

一般来说临界胶束浓度(CMC)是指聚合物分子分散在溶液中开始形成胶束时的浓度，是聚合物能否形成胶束的关键衡量值。据文章报道，TPGS可以形成胶束，但是由于其CMC(在37 ℃下是0.02%W/W)相对较高，导致在血浆中不稳定[8]，随疏水基 (亲油基)中碳原子数目的增加，其溶解度、CMC等皆有规律地减小。因此，在实验材料合成过程中，首先用乙酸酐对CDCA的羟基进行乙酰化，用于增加胆酸的亲脂性，从而获得较小的CMC值，保证其在体液稀释的情况下稳定存在。所得结果显示，乙酰化的mPEG-CDCA的CMC值为17.3×10-3mg/L，相对于TPGS较小，可以推测其形成的胶束在血浆中可能具有较好的稳定性。综上所述，mPEG-DCA能够作为一种新型的载药材料，并且有望用其制备出一种稳定性好、具有抗MDR作用的胶束纳米载药系统。

[1] Andreas S L, Ph D，Alexiou C， et al．Clinical Applications of Magnetic Drug Targeting[J]. Journal of Surgical Research, 2001,95(2):200-206.

[2] 陈龙. 大豆磷脂酰乙醇胺—聚乙二醇单甲醚2000的制备及其性能研究[D].南京：南京理工大学,2014.

[3] 刘昌程，郝京诚.去氧胆酸对TTAOH/LA体系相行为和流变性质的影响[C].中国化学会胶体与界面化学会议,2009.

[4] 张之昊，刘文清，赖宜生.胆汁酸衍生物的抗肿瘤作用研究进展[J]. 药学进展, 2010,34(11):491-498.

[5] ALLEN C, Y U Y, MAYSINGER D, et al. Polycaprolactone-b-poly(ethylene Oxide) Block Copolymer Micelles as a Novel Drug Delivery Vehicle for Neurotrophic Agents FK506 and L-685,818 [J]. Bioconjugate Chem, 1998,9(5):564-572.

[6] Xu Y, Lu Y, Wang L, et al. Nanomicelles based on a boronate ester-linked diblock copolymer as the carrier of doxorubicin with enhanced cellular uptake[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2016,141:318-326.

[7] Pu Y J，Zhang L G，Zheng H，et al. Drug release of pH-sensitive poly(L-aspartate)-b-poly(ethylene glycol)micelles with POSS cores[J]. Polym Chem, 2014,5(2):463-470.

[8] Duhem N, Danhier F, Préat V. Vitamin E-based nanomedicines for anti-cancer drug delivery[J]. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society, 2014,182(1):33-44.