张舒慧，林玉坤，李海云，段永健，杜钢军

1.河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004； 2.河南大学第一附属医院，河南 开封 475004

我国由于工业发展，空气污染加剧，人口老龄化加重，城市人口比较集中等，肺癌已经成为严重威胁人们健康的原因。目前，肺癌已经成为我国最常见的恶性肿瘤之一，位居癌症死因第一名[1]。而现代医学治疗理念注重局部治疗，目前治疗肿瘤的有效手段主要是化疗，但其毒副作用大，是最大的缺点[2]。关念波等[3]已经证明，中医药可以避免现代医学的缺点。中医药治疗疾病注重整体治疗，讲究阴阳平衡，中医药治疗在增强机体免疫功能、调节体内各脏腑生理平衡方面有独到优势。

肺癌的形成是“正气不足，而后邪气踞之”所致。在疾病早期，邪气壅盛，正气亏虚，实多虚少，应以攻邪为主、扶正为辅。马钱子科常绿乔木植物马钱的成熟种子马钱子是一味中药，在本草纲目中就早有记载：苦，寒，有大毒，归肝、脾经。马钱子具有散结消肿，通络止痛的功效[4]。谢宝仙等[5]研究了马钱子的主要有效成分是马钱子碱和的士宁。有文献[6]称马钱子中有效成分可以显著抑制肺癌细胞。本实验为了研究马钱子水煎液对肺癌细胞增殖和迁移的作用，并验证其在体内的过程，建立小鼠Lewis气管滴注模型，观察马钱子水煎液对体内Lewis肿瘤细胞的影响和小鼠生理病理变化。

1 材料

1.1 试剂及其配制

PBS：NaCl 8 g,KCl 0.2 g,Na2HPO4·12H2O 3.63 g,KH2PO40.24 g,溶于900 mL双蒸水中,用盐酸调pH值至7.4,加蒸馏水定容至1 L;DMEM/1640培养基。

胰蛋白酶消化液：先配置质量分数为0.25%的胰酶，取0.5g胰酶充分溶解于200 mL冷浴过的D-Hanks中；再配制体积分数为0.2%的EDTA，即取0.2 g EDTA充分溶解于100 mL D-Hanks中，然后量取质量分数0.25%的胰蛋白酶2份和体积分数0.2%的EDTA溶液1份混匀，无菌过滤，分装至小瓶中，密封，4 ℃保存备用。

MTT：称取10 mg MTT，加入到2 mL的PBS中，充分溶解，即PBS 5 g/L,避光处理，现用现配。

马钱子水煎液：马钱子水煎液离心后，无菌过滤，放置4 ℃冰箱保存，为体内实验用(体内实验用体积分数为0.5%的CMC-Na配置)。

苏木精：配制完成之后成熟3 mon后使用。

盐酸酒精： 取0.75 mL浓盐酸加入到体积分数为70%的乙醇100 mL中混匀。

伊红：取体积分数为95%的酒精100 mL，加入到0.75 g伊红中，搅拌1 h，静置，使用上清。

CMC-Na：取CMC-Na 0.5 g和蒸馏水100 mL配置。

马钱子水煎液的制备：取生马钱子加水煎煮，浓缩备用。

1.2 动物与细胞

昆明小鼠，体质量(20～28)g，河南大学药理实验室提供；小鼠肺癌Lewis细胞(上海细胞研究所)，取完全培养基DMEM+体积分数为10%的胎牛血清，在含体积分数为5%的CO2培养箱中37 ℃传代培养。

1.3 实验仪器

OptiMairTM垂直流超净工作台(新加坡艺思高科技有限公司)；GX71/GX51倒置金相系统显微镜(奥林巴斯中国有限公司)；电热恒温烘干箱(旭朗机械设备企业)；立式高压蒸汽灭菌锅(济南博鑫生物技术有限公司)；立式超大容量冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)；海尔冰箱BCD-329WDVL(海尔集团)；细胞培养箱(浙江赛德仪器设备有限公司)；西马力/BMA 非接触式点温仪(北京西马力检测仪器有限公司)；电子天平(舜宇恒平上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；XPE504精密电子天平(梅特勒-托利多国际有限公)；YLS-1A多功能小鼠自主活动记录仪(北京众实迪创科技发展有限责任公司)；英泰TD4B迷你型低速离心机(长沙英泰仪器有限公司)；90-2恒温磁力搅拌器(北京浩开科技有限公司)；CUT6062全自动石蜡切片机(SLEE医疗有限公司)；HH-S4多孔恒温水浴锅(上海况胜实业发展有限公司)；美国BIOTEK ELx808吸收光酶标仪(上海珂淮仪器有限公司)。

2 方法

2.1 体外实验

2.1.1 细胞增殖实验 取对数生长期的小鼠Lewis肺癌细胞，用胰蛋白酶消化后，以每孔6×103个细胞接种到96孔板上，每个药物浓度设置6个复孔，细胞在含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，在体积分数为5%CO2、37 ℃的培养箱里培养，24 h之后加入不同浓度的马钱子水煎液(设置浓度梯度为0、2.5、5、10、20 g/L)。用马钱子水煎液分别处理48 h后加入配好的MTT(5 g/L，PBS配)在培养箱里培养4 h，弃上清，每孔加入100 μL二甲基亚砜(DMSO)，结晶充分溶解后用酶标仪在490 nm处测量其吸光度，计算抑制率和生长指数。

存活率(%)=A(加药组)/A(对照组)×100%。

2.1.2 细胞划痕试验 选择对数生长期的Lewis细胞，胰蛋白酶消化，用完全培养基(含体积分数为10%的胎牛血清的DMEM培养基)调整细胞浓度为1×105/mL，接种于3孔板中，每孔200μL，在体积分数为5% 的CO2、37 ℃培养箱进行培养，培养至细胞单层铺满6孔板底部，用无菌的10μL枪头在孔中划平行的划痕，用无菌PBS冲洗划落的细胞3次，设置模型组和给药组，模型组加入完全培养基，给药组加入马钱子水煎液和低浓度血清的DMEM培养基，于0、12、24h进行观察，拍照，检测其迁移能力。

2.2 体内实验

2.2.1 建立小鼠Lewis气管滴注模型 小鼠腋下接种约1×106个Lewis细胞0.2mL，待20d后肿瘤形成后用颈椎脱臼法处死荷瘤小鼠，用体积分数为75%的乙醇浸泡小鼠消毒，无菌条件下剥离肿瘤组织块，用预冷的生理盐水洗净剪碎，用研磨器研磨组织制备细胞悬液，之后在1 000r/min，离心5min,重复两次，用生理盐水调节细胞浓度为5×106/mL，此即瘤细胞悬液。取体质量为(18～28)g的20只昆明鼠腹腔注射体积分数为0.5%的戊巴比妥钠(0.1mL/10g)，麻醉生效后即进行气管滴注，每只小鼠滴注Lewis细胞悬液10μL，从而建立Lewis气管滴注模型。

2.2.2 分组 接种后对20只小鼠进行分组，每组10只分成2组，分别标记为：给药组、模型组。

2.2.3 给药 接种当日开始灌胃给药，1次/d(给药浓度0.1g/kg)，连续给药七周后处死。

2.2.4 肿瘤生长监测和体征监测 间隔4d记录小鼠体质量、自主活动、体温1次，连续7周，观察小鼠造模后的生存质量差异。

2.2.5 马钱子水煎液对小鼠病理特征的影响 对解剖的肺组织进行石蜡包埋，切片，HE染色，封片，在高级正置金相显微镜下观察Lewis气管滴注模型在马钱子水煎液的作用下的病理学变化。

2.3 统计学方法

实验数据用Graphpadprism软件处理，两组间差异性比较采用t检验。P<0.05，表示有显著性差异。

3 结果

3.1 MTT法测定马钱子水煎液对细胞增殖的影响

以浓度为2.5、5、10、20g/L的马钱子水煎液处理Lewis细胞,48h后计算抑制率，分别为20.31%、24.42%、38.55%、57.37%。半数抑制浓度为IC50=15.57g/L。见图1。

3.2 对细胞迁移的影响

划痕试验采用浓度为5g/L的马钱子水煎液处理细胞，结果如图2所示，马钱子水煎液处理Lewis细胞，在12h时给药组细胞的迁移距离明显小于模型组迁移距离，在24h时更明显。

图1 马钱子水煎液对细胞增殖的影响

3.3 对小鼠体质量的影响

模型组小鼠体质量有逐渐减轻趋势，给药组小鼠体质量有上升趋势，给药组的体质量相比模型组有显著性差异(P<0.01)。见图2。

图2 马钱子水煎液作用下的生长曲线

3.4 对小鼠体温的影响

模型组和给药组背温、腹温、尾温均下降，给药组体温更接近正常组。给药组和模型组的背温、尾温和腹温均有显著性差异(P<0.01)。结果见图3。

3.5 对小鼠自主活动的影响

给药组小鼠自主活动和正常组相比次数少，但与模型组比较次数多，具有显著性差异(P<0.01)。见图4。

3.6 马钱子水煎液对小鼠Lewis气管滴注小鼠肺癌模型的生理特性的影响

正常组肺癌组织的细胞核明显小于模型组和马钱子水煎液给药组，模型组可见明显的细胞核增大，细胞核距离紧密，细胞质和细胞核比例失调，核仁增大增多，空洞缩小；而马钱子水煎液给药组细胞核明显小于模型组，细胞质和细胞核比例接近正常组，空洞大于模型组但小于正常组。见图5。

图3 马钱子水煎液对小鼠体温的影响

图4 实验期间小鼠自主活动的变化

图5 马钱子水煎液对小鼠Lewis原位肺癌模型病理变化的影响

4 讨论

恶性肿瘤是威胁人类健康的严重疾病之一[7]。现代医学治疗肿瘤的手段主要有化疗、手术、放疗等，而化疗药物对肿瘤细胞和正常细胞的选择性差，化疗药物毒副作用限制了化疗的发展[8-9]。中医学认为，应察病机而定治则，根据病变发展之阶段，详审邪正盛衰，辩清虚实，以及虚实的多少，辩证地使用攻补之法。陈剑锋[10]提出，中药具有多成分多靶点的特点。由于中药的成分较多，可以通过多种途径达到抑制肿瘤发展的作用。

本实验通过体内、体外两种途径验证了马钱子水煎液的抗Lewis肺癌细胞的作用。体外实验用MTT法和划痕试验证明马钱子水煎液对肿瘤细胞Lewis有抑制增殖和迁移的作用并呈剂量、时间依赖；体内实验通过体质量、体温、自主活动的变化曲线初步得出马钱子水煎液能改善小鼠Lewis气管滴注模型的生长状态。组织HE染色进一步证明马钱子水煎液可以改善小鼠肺癌模型的病理状态。

肿瘤在体内表现为积聚癓瘕，盘根错节，肿块日渐增大，易用消瘤攻坚，通利破积之峻药。马钱子具有细胞毒性，古书记载其具有散血热，消肿毒之功效[11]。在体内实验中，给予马钱子水煎液0.1g/kg剂量，小鼠并未出现马钱子中毒症状，说明给予剂量不足以使小鼠出现惊厥。实验过程中发现，降低马钱子浓度可以降低毒性。建议应该通过降低马钱子中毒性成分的浓度来寻求发展马钱子抗肿瘤的途径。

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[4] 王小春. 马钱子药理毒理及安全性探究[J]. 世界最新医学信息文摘,2015,15(90):212-213.

[5] 解宝仙,唐文照,王利红,等.马钱子化学成分研究[J]. 中药材,2016,21(1):86-89.

[6] 张芳,徐春蕾,王筱曚,等.基于士的宁和马钱子碱为主要活性成分的马钱子抗肿瘤活性研究[J]. 中华中医药杂志,2014,15(11):3491-3493.

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