聚维酮碘溶液对子宫内膜细胞的灭活作用研究

2017-01-20周慧芳王梦甜单佳雯吴建宇杨立伟何徐军

浙江医学 2016年24期

周慧芳洪敏王梦甜单佳雯吴建宇杨立伟何徐军

周慧芳洪敏王梦甜单佳雯吴建宇杨立伟何徐军

目的探寻聚维酮碘溶液快速灭活子宫内膜细胞的最佳有效浓度和作用时间，并对聚维酮碘溶液诱导子宫内膜细胞凋亡作用进行研究。方法不同浓度（0.1％～2.0％）、不同时间（15～90s）的聚维酮碘溶液作用原代培养子宫内膜细胞，采用MTT染色实验检测聚维酮碘溶液对子宫内膜细胞的灭活作用，Hoechst33342染色实验和流式细胞术检测聚维酮碘溶液对子宫内膜细胞促凋亡作用。结果聚维酮碘溶液对子宫内膜细胞具有明显的灭活作用，呈浓度依赖和时间依赖，且随着聚维酮碘溶液浓度的增加，子宫内膜细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）。结论聚维酮碘溶液可有效灭活子宫内膜细胞，对预防腹壁子宫内膜异位症的发生有着重要的临床应用意义。

聚维酮碘腹壁子宫内膜异位症子宫内膜细胞凋亡

子宫内膜异位症是指具有生长活力的子宫内膜组织在子宫腔以外部位异常生长。子宫内膜异位症常见于育龄妇女,其发病机制尚未阐明，Luciano等[1]提出种植理论,认为子宫内膜异位症是由经期返流的内膜细胞从输卵管逃逸后在盆腔周围组织种植后形成。腹壁子宫内膜异位症（abdominalwall endometriosis，AWE）是指发生于腹膜表面的异位内膜病灶[2-4]。目前，除了规范剖宫产技术，用常温0.9％氯化钠溶液反复冲洗切口是预防AWE最常用的方法，但剖宫产术后AWE的发生还是呈逐年增长趋势[5-6]。聚乙烯吡咯烷酮和碘络合形成的聚维酮碘是一种临床常用的广谱消毒剂[7-9]。本研究利用聚维酮碘溶液不同浓度和浸泡时间对子宫内膜细胞进行灭活处理，以期能找到聚维酮碘快速灭活子宫内膜细胞的最佳有效浓度和作用时间，并对聚维酮碘溶液诱导子宫内膜细胞凋亡作用进行研究。

1 材料和方法

1.1 材料聚维酮碘溶液购自上海运佳黄浦制药有限公司；MTT[3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐]、Hoechst33342染色液购自江苏碧云天生物科技有限公司；AnnexinⅤ/PI凋亡试剂盒购自杭州联科生物科技有限公司。

原代培养的子宫内膜细胞均取自本院产科的择期剖宫产术产妇。产妇年龄22～35（27±4.5）岁；足月妊娠、耻骨联合上横切口。剖宫产术产妇胎盘娩出后刮取子宫内膜，一部分内膜组织投入盛有培养液的无菌瓶中，30min内带回进行培养。另一部分内膜组织用10％中性甲醛固定后送病理学检查，经组织学证实为子宫内膜者进行实验，不符合者舍弃。实验室取回的标本用D-Hank’s液冲洗3次，剪碎至＜1mm，再置于含0.25％ Trypsin、0.02％胶原酶的消化液中37℃振荡消化20～30min。加入含20％FBS的RPMI1640培养基终止消化，并用Pasteur吸管反复抽吸、吹打，对细胞群进行机械消化。洗涤后，置入37℃、5％CO2培养箱中培养。标本留取经医院伦理委员会批准和产妇同意。

1.2 方法

1.2.1 MTT染色检测细胞增殖收集对数生长期子宫内膜细胞，调整细胞悬液浓度，将细胞以100μl/孔接种于96孔板，使待测细胞密度为1×104/孔。5％CO2、37℃孵育24h后，吸出培养液，分别加入0.1％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％的聚维酮碘溶液100μl，分别作用15、30、45、60和90s，以0.9％氯化钠溶液作为对照。每孔加入20μl MTT溶液（5mg/ml，即0.5％MTT），继续培养4h。吸去孔内培养液。每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪于490nm处测量各孔的吸光值（OD）。细胞存活率=（OD药物作用孔-OD调零孔）/（OD对照孔-OD调零孔）×100％。

1.2.2 Hoechst33342染色观察肿瘤细胞的凋亡对数期子宫内膜细胞按3.5×105个/ml接种至6孔板中，贴壁培养24h后，吸出培养液，分别加入0.1％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％的聚维酮碘溶液100μl，分别作用15、30、45、60和90s，以0.9％氯化钠溶液作为对照。加入10μg/ml的Hoechst33342染料。37℃染色30min后荧光倒置显微镜观察，然后置于共聚焦显微镜下拍照。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率对子宫内膜细胞处理与Hoechst33342染色观察肿瘤细胞的凋亡方法相同，参照AnnexinⅤ/PI细胞凋亡检测试剂盒操作说明：收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞两遍，用100μl的1× Binding Buffer重悬细胞，加入5μl的AnnexinⅤ和1μl的PI，冰上避光15min后，加入400μl 1×Binding Buffer，采用流式细胞仪分析。

1.3 统计学处理采用SPSS 11.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 子宫内膜细胞形态图1为子宫内膜细胞的形态，细胞贴壁状态良好，呈梭形，证明本研究细胞培养成功。

图1 子宫内膜细胞形态图

2.2 不同浓度及时间梯度下聚维酮碘溶液对子宫内膜细胞的抑制作用采用不同浓度的聚维酮碘溶液处理子宫内膜细胞后，MTT实验表明，聚维酮碘对子宫内膜细胞具有明显的增殖抑制作用，呈浓度依赖和时间依赖（P＜0.05）。2.0％聚维酮碘溶液的抑制率最高，当作用时间分别为15、30、45、60和90s时，细胞存活率仅为（4.0±1.3）％、（3.2±1.5）％、（1.9±1.8）％、（1.3±2.2）％和（0.2±1.1）％，见图2。

图2 MTT实验检测子宫内膜细胞存活率

2.3 细胞形态学变化采用不同浓度聚维酮碘溶液处理子宫内膜细胞15s后，子宫内膜细胞生长受到明显抑制，出现典型的凋亡形态学变化，细胞皱缩、细胞膜出现发泡现象。用Hoechst33342染色子宫内膜细胞，细胞凋亡效应明显。对照组染色质均匀，无浓缩、边集现象，荧光显微镜下观察，细胞核染色均一，无明显亮蓝色；而不同浓度聚维酮碘溶液处理组细胞核染色质明显凝集、固缩，并有核碎裂出现凋亡小体。荧光显微镜下观察，呈现致密浓染或者碎块状致密浓染，见图3（见插页）。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率采用不同浓度聚维酮碘溶液处理子宫内膜细胞15s后，收集细胞，经AnnexinⅤ/PI双染后，流式细胞仪检测细胞凋亡。在AnnexinⅤ高染而PI低染区域的细胞为早期凋亡细胞，在AnnexinⅤ与PI高染区域的细胞为晚期凋亡细胞，结果显示，随着聚维酮碘溶液浓度的增加，子宫内膜细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），见图4-5。

图4 不同浓度聚维酮碘溶液处理后细胞凋亡率变化（a:对照组；b～f：分别表示经0.1％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％聚维酮碘溶液处理的剂量组）

图5 流式细胞仪检测细胞凋亡率统计图

3 讨论

AWE是一种特殊类型的盆腔外子宫内膜异位症，虽为一种良性病变，但具有类似恶性肿瘤的生物学特征，如局部侵犯、远处播散、易复发等[2，10-11]，表现为周期性腹壁切口增大的包块和经期腹壁切口疼痛，严重影响患者的健康和生活质量。赵学英等[12]研究认为医源性子宫内膜种植是引起AWE的直接原因，剖宫产术中胎儿胎盘的娩出、子宫内膜的大量组织碎片散落并遗留在腹壁切口上，使子宫内膜基质层有更多的医源性机会黏附在腹壁切口上，导致子宫内膜的种植。因此，剖宫产术中采取有效的措施避免子宫内膜组织散落和遗留在腹壁切口是预防本病的关键。目前，剖宫产术后AWE的发生还是呈逐年增长趋势，因此，寻找一种便捷、有效、安全的冲洗方法以清除遗留在手术切口的子宫内膜组织，控制医源性子宫内膜种植，对预防AWE的发生有着重要的意义。

聚维酮碘是目前临床上常用的一种化学消毒剂。有研究报道聚维酮碘对预防肿瘤细胞转移有一定的效果[8，13]，黄惠等[14]研究发现聚维酮碘对肺癌肿瘤细胞有明显的抑制效果,李俊等[15]研究了聚维酮碘对人角膜内皮细胞的影响。对于聚维酮碘对细胞的杀伤机制，有研究证明“游离碘”可在短时间内对有机体内细胞蛋白产生不可逆转的凝固作用[16]。本研究结果表明，2.0％聚维酮碘溶液抑制子宫内膜细胞效率最高，当作用时间分别为15、30、45、60和90s时，细胞存活率仅为（4.0±1.3）％、（3.2±1.5）％、（1.9±1.8）％、（1.3±2.2）％和（0.2±1.1）％，考虑到聚维酮碘溶液冲洗切口的便利性，以2.0％浓度、15s作用时间的聚维酮碘溶液对子宫内膜细胞的抑制最高，为最佳实验条件。

[1]Luciano A A,Pitkin RM.Endometriosis:app roaches to d iagnosis and treatm ent[J].Surg Annu,1984,16(16):297-312.

[2]Patterson G K,Winburn G B.Abdom inalwallendom etriomas:reporto feightcases[J].American Surgeon,1999,65(1):36-39.

[3]Zhao X,Lang J,Leng J,et al.Abdom inalwa llendometriomas[J]. International Journal of Gynecology&Obstetrics,2009,54(89): 59-60.

[4]Picod G,Boulanger L,Bounoua F,et al.Abdom inal wall endometriosis after caesarean section:report of fifteen cases[J]. 2006,34(1):8-13.

[5]唐丽华,鹿欣,朱芝玲,等.腹壁切口子宫内膜异位症32例临床分析[J].现代妇产科进展,2007,17(10):773-774.

[6]赵爱荣.腹壁子宫内膜异位症的研究进展[J].医学理论与实践,2013, 26(11):1435-1437.

[7]鲁东红,石一复.剖宫产后的妇科问题[J].国际妇产科学杂志,2011, 38(1):79-81.

[8]巴剑波,刘玉明,殷明,等.聚维酮碘特性及其制剂研究进展[J].中国消毒学杂志,2010,27(1):67-69.

[9]Pattana-Arun J,Wolff B G.Benefits o f Povidone-Iod ine Solution in Colorecta lOperations:Science or Legend[J].Diseases of the Colon&Rectum,2008,51(6):966-971.

[10]Favoulet P,Benoit L,Guiu B,et al.Evaluation of povidone abdom inalwashing for p revention o f peritoneal cancer cellseeding:experimentalstudy in the rat[J].Annales De Chirurgie,2002, 127(8):600-605.

[11]Paszkow iak J,Dud rick S,Dard ik A.Abdom inalWallEndom etrioma[J].Polish Journalo fSurgery,2007,79(4):319-321.

[12]赵学英,郎景和,冷金花,等.腹壁子宫内膜异位症的临床特点及复发相关因素分析[J].中华妇产科杂志,2004,39(2):97-100.

[13]Luciano A A,Pitkin RM.Endom etriosis:app roaches to d iagnosis and treatm ent[J].Surgery Annua l,1984,16(16):297-312.

[14]黄惠,李映兰.不同稀释度聚维酮碘在肺癌手术中的应用研究[J].解放军护理杂志,2013,30(5):20-23.

[15]李俊,李维英,彭智培,等.聚维酮碘对人角膜内皮细胞的影响[J].中华眼科杂志,2005,41(2):169-172.

[16]Tsivian A,Sid i A A.Port site metastases in urological laparoscop ic surgery[J].Journalo fUrology,2003,169(4):1213-1218.

ObjectiveTo investigate the effec t of povidone-iodine at different concentration on the grow th of human endometrial cells.MethodsPrimary cultured endometrial cells were treated w ith d ifferent concentrations(0.1％-2.0％)of povidone-iod ine atdifferent time(15-90s),respectively.The viability,morphologicalchanges,and apop tosis ofendometrialcells were assessed by MTT assay,Hoechst33342 staining,and Annexin V/PI flow cytometry,respec tively.ResultsThe results indicated thatpovidone-iod ine remarkab ly inhibited endometrialcells g row th ata dose-dependentand time-dependentmanner (P＜0.05).ConclusionPovidone-iod ine solution can effec tively inactivate endometrial cells,which may potential c linicaluse in p revention ofendometriosis.

Povidone-iod ine Abdom inalwallendometriosis Endometrialcells Apop tosis