线粒体蛋白表达与原发性胆汁性肝硬化病情进展的相关性

2017-01-20杨小艳钟玉全

浙江医学 2016年24期

杨小艳张旭钟玉全

杨小艳张旭钟玉全

目的探讨线粒体蛋白对于原发性胆汁性肝硬化（PBC）病情进展的诊断价值。方法收集120例PBC患者肝组织活检标本，其中60例为PBC初期破坏性胆管炎期，60例为PBC终末期肝硬化期，通过AST和ALT水平、免疫组织化学染色及小胆管与胆管量化分析，探究丙酮酸脱氢酶复合-E2（PDC-E2）、细胞色素C氧化酶亚型I（CCO）、微管相关蛋白轻链3β（LC3）、p62、p16INK4a及p21WAF1/Cip1与PBC病情进展的相关关系。结果PBC终末期小胆管区域的PDC-E2和CCO表达明显高于PBC初期患者，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。PBC终末期和初期患者胆管区域的PDC-E2、CCO、LC3、p62、p16INK4a及p21WAF1/Cip1表达差异均无统计学意义（均P＞0.05）。血清AST和ALT水平与两种胆管的LC3的表达呈正相关（r=0.482、0.492、0.588、0.522，均P＜0.05），且与胆管内p16INK4a及p21WAF1/Cip1的表达呈正相关（r=0.440、0.612、0.584、0.472，均P＜0.05）。结论小胆管的线粒体蛋白表达的情况也作为评估PBC疾病进展的有效标记物，与转氨酶水平呈现正相关。

原发性胆汁性肝硬化线粒体蛋白进展

原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）是一种器官特异性的自身免疫性疾病，血清中存在抗中性粒细胞抗体是其典型特征[1]。目前肝移植是终末期PBC的主要治疗手段，由于很多其他肝脏的疾患能导致局部的炎症及胆管的破坏，组织学检测复发性PBC通常较为困难。有研究显示PBC胆道损坏的胆管上皮细胞能够特异性地表达线粒体抗原、自嗜体及老化标记物等，但不同病理阶段其表达有可能不同，其在PBC的病理进展中发挥重要作用[2-4]。笔者针对不同病理阶段的PBC患者，探究线粒体蛋白对PBC病情进展的诊断价值，以期为临床相关疾病的诊疗提供借鉴及指导。

1 对象和方法

1.1 肝组织标本及处理本研究收集本院2011年3月至2015年12月120例肝组织活检标本，其中60例诊断为PBC初期破坏性胆管炎期，60例诊断为PBC终末期肝硬化期。所有PBC患者均符合临床、血清学及组织学诊断特征。肝组织标本固定于10％中性甲醛溶液内，每块组织至少切片20张（厚度4μm），每隔5张选择一张切片进行常规苏木精-伊红、网状蛋白及苔红素染色，剩余切片进行免疫组织化学染色。本研究经医院伦理委员会和患者知情同意。

1.2 免疫组织化学染色按文献[5]报道的方法进行免疫组织化学染色，线粒体相关抗原为丙酮酸脱氢酶复合-E2（PDC-E2）和细胞色素C氧化酶亚型I（CCO）；自噬体标记为微管相关蛋白轻链3β（LC3）；失调的自噬体标记p62及老化标记p16NK4a和p21WAF1/Cip1。阻断内源性过氧化物酶后，将切片与一抗在4℃环境下过夜孵育，之后添加Envision溶液，室温静置30min，通过过氧化氢及3-3′二氨基联苯胺四盐酸盐使反应物可视化。将切片轻微通过甲基氯或苏木精进行复染色；一抗选择使用相同稀释度的小鼠或兔的免疫球蛋白G，进行组织学分析。研究中所使用的一抗分别为：PDC-E2（1∶100，Santa-Cruz）；CCO（1∶200，Invitrogen）；LC3（1∶50，Santa-Cruz）；p62（1∶1 000，MBL）；p16NK4a（1∶100，Neomarkers）和p21WAF1/Cip1（1∶100，BD transduction）。

1.3 免疫组织化学检测结果量化本研究中标本切片关注的区域主要为小胆管（室间隔及小叶间胆管）及胆管（肝门附近区域内径较大的胆管），通过量化评分评估小胆管及胆管的免疫组织化学标记物的表达程度。小胆管的免疫组织标记评分为：0分（阴性），1分（少于3处的小胆管可见阳性细胞），2分（超过3处的小胆管可见广泛存在的阳性细胞）；胆管的免疫组织标记评分为：0分（阴性），1分（少于1/3门静脉可见阳性细胞），2分（超过1/3门静脉可见广泛存在的阳性细胞）。记录每个标本得分数。

1.4 AST、ALT与线粒体蛋白的相关性检测所有PBC患者血清AST、ALT水平，分析其与线粒体蛋白表达的相关性。

1.5 统计学处理采用SPSS 20.0统计软件；计数资料组间比较采用χ2检验；采用Spearman分析AST、ALT与线粒体蛋白的相关性。

2 结果

2.1 小胆管各标记物表达情况PBC终末期患者小胆管的胆管上皮细胞PDC-E2呈颗粒状及泡状高密度表达；而在发病初期患者中小胆管内则未见PDC-E2的明显表达，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。CCO两者均有表达且差异有统计学意义（P＜0.05）。PBC终末期患者中小胆管可见LC3及p62的结节性表达，同样的表达可见于初期患者的标本内，且两者差异无统计学意义（P＞0.05）。p16INK4a及p21WAF1/Cip1仅见于两组部分患者的小胆管内，两者表达差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1和图1（见插页）。

表1 两种病变切片中小胆管区域各标记物的表达情况比较[例（％）]

2.2 胆管各标记物表达情况PBC终末期及初期患者PDC-E2、CCO、LC3、p62、p16INK4a及p21WAF1/Cip1的表达差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。

2.3 血清AST和ALT水平与标记物表达的相关性分析血清AST和ALT水平与两种胆管的LC3的表达均呈正相关（均P＜0.05），同样的相关关系亦可见于胆管内p16INK4a及p21WAF1/Cip1的表达，但其余指标的表达与血清AST和ALT水平无相关性，见表3。

3 讨论

有研究报道证实PBC受损的小胆管的胆管上皮线粒体蛋白的表达增加，并且可能与自噬体的失调有关[6-8]。本研究与之不同在于研究中纳入了PBC早期及终末期患者标本，本研究证实了线粒体蛋白（PDC-E2和CCO）的表达在终末期PBC肝脏内的小胆管内更为显著，提示其可能被用来作为终末期PBC诊断的标记物。

表2 两种病变切片中胆管区域各标记物的表达情况比较[例（％）]

表3 血清AST和ALT水平与标记物表达的相关性分析

本研究也清晰地展示出了小胆管内PDC-E2和CCO的表达可作为终末期PBC的有效诊断标记物，小胆管线粒体蛋白的表达与临床及组织学诊断PBC终末期一致。与之相对应的，若小胆管无上述两种蛋白的表达而存在LC3、p62、p16INK4或者p21WAF1/Cip1的表达，则通常相应的诊断为PBC初期，由于两者组织病理学检查中均可见典型的胆管损害，因此两者的区分存在一定的困难[6,9-12]。虽然一般认为切片中显示的胆管的肉芽肿病变即视为PBC的迹象，但实际中发现的概率仅为30％左右。少数文献就相关的诊断标记物进行过探究，一项研究表明PBC初期上皮-间质的转化可能参与了胆管的损害过程；肝移植中就PDC-E2表达免疫组织化学检测的结果参差不齐，为此本研究提供了相关证据，但仍需要大样本的病例进行深度确认。

本研究发现很多诊断为PBC初期的标本小胆管内通常可见LC3、p62、p16INK4a或p21WAF1/Cip1的表达，而线粒体蛋白的表达通常很低。部分研究主要关注于小胆管内p16INK4a或p21WAF1/Cip1的表达，PBC初期中后者的表达与胆管上皮的老化相关；在慢性同种异体肝排异及PBC内，两者均表现为肝内胆管的进行性缺失，据报道胆管上皮的老化是最主要的机制之一[13-15]。本研究进一步证实了在PBC初期中存在小胆管的胆管上皮的老化。

本研究还发现PBC初期患者中小胆管多表现LC3和/或p62的表达，而PBC标本中各种标记物的表达概率相对较高。有研究报道在PBC的胆管上皮内自噬体通常先于细胞的老化，体外的研究亦报道氧化应激、饥饿及疏水性胆汁酸等能够诱导自噬体及胆管上皮的自噬体失调[16-20]。本研究发现标记物在PBC两种病理改变时期中存在统计学差异，因此笔者设想其中相关的病理变化过程亦是不同的。

研究结果显示AST和ALT水平与两种胆管的LC3的表达显著相关，同样的相关关系亦可见于胆管内p16INK4a及p21WAF1/Cip1的表达，但相关的机制仍不清楚，可能的推测为严重的肝脏损伤可导致干细胞及胆管上皮自噬体的失调改变。

综上所述，本研究初步证实小胆管的线粒体蛋白表达可作为PBC终末期的有效诊断标记物。

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ObjectiveTo investigate the association between the exp ression of m itochond rial p roteins and the p rogression of p rimary biliary cirrhosis(PBC).MethodsBiopsy specimens were taken from 120 PBC patients,inc lud ing 60 cases of early stage and 60 cases of end stage.Serum AST and ALT levels were measured,and the exp ressions of pyruvate dehyd rogenase-E2(PDC-E2),cytochrome c oxidase isoform I(CCO),m icrotubule-associated p rotein light chain 3β(LC3), p62,p16INK4a and p21WAF1/Cip1 in tissue sam p les were detected by immunohistochem ical staining.The correlation between the exp ression ofm itochond rial p roteins and the p rog ression of PBC was analyzed.ResultsThe exp ression of PDC-E2 and CCO in the smallbile ductarea ofend stage PBC was significantly higher than that in the early stage PBC(all P＜0.05).However, there were no significantdifferences in the exp ression of PDC-E2,CCO,LC3,p62,p16INK4a and p21WAF1/Cip1 in the bile duct between end-stage and early stage PBC(all P＞0.05).The serum levels of AST and ALT were positively correlated w ith the exp ression of LC3(r=0.482,0.492,0.588,0.522,all P＜0.05)in smallbile duct and bile duct,and correlated positively w ith the exp ression of p16INK4a and p21WAF1/Cip1 in the bile ducts(r=0.440,0.612,0.584,0.472,all P＜0.05).ConclusionThe exp ression ofm itochond rialp roteins in smallbile ducts is positively correlated w ith serum transam inase levels,which may be an usefulbiomarker for the d isease p rog ression of PBC.

Primary biliary cirrhosis Mitochond rialp rotein Prog ressing