傅荣兵，章 霞，徐志进，邱豪军，蒋霞敏

（1.宁波大学，浙江宁波 315211；2.浙江省舟山市水产研究所，浙江舟山 316000）

不同饵料对褶皱臂尾轮虫氨基酸脂肪酸组成的影响

傅荣兵1,2，章 霞2，徐志进2，邱豪军2，蒋霞敏1

（1.宁波大学，浙江宁波 315211；2.浙江省舟山市水产研究所，浙江舟山 316000）

为探究海洋红酵母和浓缩小球藻作为轮虫培育饵料的可行性，采用3种不同饵料（小球藻、浓缩小球藻、海洋红酵母）单独或混合对轮虫进行投喂，并测定这3种饵料以及不同试验组轮虫的氨基酸、脂肪酸两项指标来比较评价不同饵料对褶皱臂尾轮虫的营养价值。结果表明：3种饵料的小球藻非必需氨基酸总量显著高于其他两种饵料（P<0.05），浓缩小球藻的必需氨基酸含量最高；3种饵料中小球藻的饱和脂肪酸含量显著高于其他两种生物饵料（P<0.05），不饱和脂肪酸含量总量以海洋红酵母为最高，海洋红酵母的顺式油酸含量是小球藻和浓缩小球藻的14.1倍，顺式亚油酸是小球藻和浓缩小球藻的7.11和6.96倍。不同饵料投喂轮虫的氨基酸、脂肪酸比较结果表明，红酵母搭配2种藻类投喂轮虫相比单一饵料投喂轮虫的必需氨基酸含量有明显提高，但对提高轮虫脂肪酸含量效果欠佳。可见海洋红酵母和浓缩小球藻可以作为优良的轮虫培育饵料，这也将为轮虫的营养优化和大规模养殖技术发展提供参考。

褶皱臂尾轮虫；海洋红酵母；氨基酸；脂肪酸

1960年，褶皱臂尾轮虫Brachionus plicatilis因其繁殖快、抗逆性强、营养价值高等特性被确认为海水育苗及甲壳类幼体必要的饵料生物，迄今为止，无可替代，由此也成为了海水育苗成功的关键环节[1]。众所周知，轮虫易于养殖，食性广泛，细菌、单胞藻、豆浆、酵母，发酵生物等有机碎屑，均可用于轮虫培育。但由于有机碎屑易于败坏水质导致培育生态系统不稳定，当前在实际生产中轮虫的大规模培养主要采用的是单细胞藻类作为饵料进行培养[2]。然而大量单细胞藻类的培养耗资巨费，因而众多专家学者开展了酵母、单胞藻类单独或者共同培育轮虫技术的研究。

廖永岩等[3]以面包酵母为饵料开展了人工海水培养褶皱臂尾轮虫的研究。王金秋等[4-6]研究了面包酵母和啤酒酵母2种酵母单独投喂萼花臂尾轮虫Brachionus calyciflorus在最适密度、饵料效果及与藻类搭配的投喂效果等方面的研究，并对比分析了面包酵母和啤酒酵母对萼花臂尾轮虫的营养价值，此外还研究了两种酵母和两种藻类对于褶皱臂尾轮虫的最适投喂密度。张雅芝等[1]利用正交设计方法，研究了不同水温条件下，不同饵料和接种密度对褶皱臂尾轮虫种群增长的影响，其中酵母饵料选择的是干面包酵母。夏连军等[7]利用干酵母作为褶皱臂尾轮虫的饵料进行了工厂化培养试验的研究等。纵观现有报道，目前多数学者主要研究面包酵母、啤酒酵母作为饵料对于轮虫进行培养，而关于以海洋红酵母、小球藻浓缩液为饵料对于轮虫进行培养的研究未见报道。

因而本文将对于利用海洋红酵母、小球藻、小球藻浓缩液作为培育饵料投喂轮虫，并采用氨基酸、脂肪酸两项指标来评价不同饵料对褶皱臂尾轮虫的营养价值。探究海洋红酵母以及小球藻浓缩液在轮虫培育饵料上的应用价值。

1 材料和方法

1.1 试验材料

饵料组成，X组：小球藻；N组：浓缩小球藻；H组：海洋红酵母；X+H组：小球藻+海洋红酵母；N+H组：浓缩小球藻+海洋红酵母，每组3桶。

褶皱臂尾轮虫种由舟山市水产研究所提供，轮虫生存状态良好。

1.2 试验方法

采用YPD培养基装液量为80 mL/500 mL的三角锥形瓶培养海洋红酵母，30℃，160 r/min，48 h后计数，约为2.25×109个/mL，离心，置于4℃备用。

小球藻在室内藻类室牛奶桶中曝气培养5 d后，计数约为4×106个/mL，待用。

浓缩藻购置于东营大振生物工程有限公司，计数为8×109个/mL。

取18个120 L的白色PE桶（51×46×80），放入100 L水，接种提前空白暂养2 d的空白组，使各桶轮虫密度维持在30个/mL左右。每天早（08:00）、中（16:00）、晚（24:00）对用投喂饵料，X组：小球藻密度维持在4×105个/mL；N组：浓缩藻密度维持在4×105个/mL；H组：海洋红酵母密度维持在（10～15）×105个/mL；X+H组：小球藻密度维持在2×105个/mL，海洋红酵母维持在（5～7.5）×105个/mL；N+H组：浓缩藻密度维持在2×105个/mL，海洋红酵母在（5～7.5）×105个/mL。每24 h取样，观察成活率，显微照像，96 h用300目筛绢网收集每桶的轮虫，用洁净海水冲洗3～4遍，装于50 mL离心管，用灭菌1.5%生理盐水4 000 r/min离心3 min，反复3遍，舍弃上清液，-20℃，冷冻待测。

氨基酸测定：用5%的磺基水杨酸提取100 mg的样品，每次用2 mL提取，超声10 min。提取2次，2次的提取液合并后离心，采用agilent 1260测定。

脂肪酸组成的测定：

（1）提取：将样品放入50 mL离心管，用玻璃棒将菌丝绞碎，加入5 mL超纯水搅拌溶解，再加入40 mL混合溶剂（乙醇：乙醚：石油醚=2:1:1），用力摇5 min，在3 500 r/min离心5 min，吸取上层清夜到烧杯；第二次加入10 mL混合溶剂（石油醚：乙醚=1:1），在3 500 r/min离心5 min，吸取到烧杯；在45℃的水浴锅吹氮气，直至吹干。

（2）甲酯化：加2 mL正己烷到烧杯中，将油脂溶解，倒入5 mL带盖玻璃管，加入0.5 mL KOH—甲醇溶液（4 mol），振荡1 min，静置直至上层清液清澈，吸取上层清液，上机。

（3）色谱条件：安捷伦气相色谱仪7820；色谱柱：DB-23（30 m×0.25 m×0.25 μm）；检测器：FID；进样口温度：300℃，检测器温度：250℃，进样量为1 μL。初始温度为50℃，以10.0℃/min升温至180℃，保持5 min再以5.0℃/min升温至230℃，保持2 min，分流比20:1。脂肪酸的定量分析采用面积归一法计算而得。

1.3 数据分析

试验所得数据使用统计软件EXCEL2007和SPSS17.0进行单方面方差分析（One-way ANOVA）检验。

2 结果

2.1 3种饵料的氨基酸组成比较

由表1可见3种饵料的游离氨基酸含量各有不同，其中小球藻的非必需氨基酸总量显著高于浓缩小球藻和海洋红酵母（P<0.05），特别是谷氨酸含量分别是浓缩小球藻的6.01倍，海洋红酵母的11.6倍，丝氨酸含量也显著高于其他两种生物饵料（P<0.05），分别是浓缩小球藻的8.52倍，海洋红酵母的4.59倍，而浓缩藻、海洋红酵母的组氨酸显著高于浓缩小球藻（P<0.05）。3种饵料中的必需氨基酸含量以浓缩小球藻最高，各自的优势氨基酸也有所不同。小球藻、浓缩小球藻的必需氨基酸以缬氨酸含量最高，是海洋红酵母的18倍和12.42倍，而海洋红酵母以精氨酸含量最高，是小球藻3.41倍，浓缩小球藻的79.86倍。可见，优化3种微生物饵料的配比可能提高轮虫的营养价值。

表1 3种饵料的氨基酸组成（单位：mg/g）Tab.1 Amino acid composition of three kinds of bait(unit:mg/g)

2.2 3种微生物饵料的脂肪酸组成比较

3种饵料的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量不尽相同（表2）。其中小球藻的饱和脂肪酸含量显著高于其他饵料（P<0.05），是浓缩小球藻1.88倍，海洋红酵母1.6倍。其中棕榈酸是3种饵料的优势饱和脂肪酸，海洋红酵母的山酸含量是小球藻的4.54倍。3种饵料的不饱和脂肪酸含量总量以海洋红酵母为最高，其中小球藻和浓缩小球藻的棕榈油酸含量是海洋红酵母21.9～24.8倍，海洋红酵母的顺式油酸含量是小球藻和浓缩小球藻的14.1倍，顺式亚油酸是小球藻和浓缩小球藻的7.11和6.96倍。浓缩小球藻的α—亚油酸（C18：3n3）显著低于海洋红酵母和小球藻（P<0.05）。浓缩小球藻的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量都显著低于另外两种饵料（P<0.05）。其中浓缩小球藻的饱和脂肪酸含量是小球藻的53.25%，海洋红酵母的85.20%，浓缩小球藻的不饱和脂肪酸含量是小球藻的67.31%，海洋红酵母的58.10%。

表2 3种饵料的脂肪酸组成（%）Tab.2 Fatty acids composition of three kinds of bait(%)

2.3 不同饵料投喂对轮虫的氨基酸组成的影响

由表3可知，不同饵料培养的轮虫的氨基酸含量以小球藻+海洋红酵母为最高，最低为浓缩小球藻。5个试验组的非必需氨基酸含量以小球藻+海洋红酵母组最高，显著高于相应的相应的单一饵料组（P< 0.05），为小球藻组的4.31倍，是海洋红酵母组的6.67倍。混合组浓缩小球藻+海洋红酵母的氨基酸含量低于相应的单一饵料培养组。5个试验组中的小球藻+海洋红酵母组的必需氨基酸含量是相应的单一饵料组小球藻组的4.48倍，海洋红酵母组的6.60倍，浓缩小球藻+海洋红酵母组的必需氨基酸含量是相应的单一饵料组的浓缩小球藻组的3.51，海洋红酵母组的1.07倍。可见海洋红酵母和小球藻、浓缩藻的混合投喂能明显提高单一饵料投喂轮虫的必需氨基酸含量，但是浓缩小球藻+海洋红酵母组对提高相应单一饵料培养的轮虫的非必需氨基酸含量效果不佳。单一饵料、混合饵料培养的轮虫的氨基酸差异较大。

2.4 不同饵料投喂对轮虫的脂肪酸组成的影响

5个试验组中，以小球藻组轮虫的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸含量最高，海洋红酵母组轮虫的多不饱和脂肪酸含量最高，见表4。混合饵料组小球藻+海洋红酵母组轮虫的饱和脂肪酸高于单一饵料组海洋红酵母组的轮虫含量，是其1.01倍，略低于小球藻组的轮虫含量，两个混合饵料组小球藻+海洋红酵母组、浓缩小球藻+海洋红酵母组的轮虫的单不饱和脂肪酸含量均低于相应的单一的饵料投喂组。混合饵料组小球藻+海洋红酵母组轮虫的多不饱和脂肪酸含量低于相应的单一饵料培养组，是小球藻含量的94.9%，显著低于海洋红酵母组，是海洋红酵母的76.78%（P<0.05），混合饵料组浓缩小球藻+海洋红酵母组轮虫的多不饱和脂肪酸含量低于单一饵料组海洋红酵母组，含量为海洋红酵母组的87.67%，高于单一饵料组浓缩小球藻组，是浓缩小球藻组的1.03倍。而影响海洋养殖生物生长发育高度不饱和脂肪酸EPA含量依次是N>N+H>X>X+H>H，DHA含量依次为X>X+H>H>N+H>N，可见混合组对改善轮虫单种饵料培养的脂肪酸含量效果不佳。

表3 5组轮虫的氨基酸组成（单位：mg/g）Tab.3 Amino acid composition of five group of rotifers(unit:mg/g)

3 讨论

3.1 浓缩小球藻在轮虫培育上的应用价值

轮虫的大规模培养的限制因素很多，例如饵料、密度、溶解氧、pH、盐度、温度等，其中饵料是重要的限制因素，当前小球藻是经研究证明适宜大规模培育轮虫的优质饵料[8-9]，但也存在供应不及、易老化、营养单一、耗时耗力的问题[10]，为减少小球藻供应压力，当前发展用浓缩小球藻替代的新方法[11-13]。浓缩小球藻具有生物量大、运输方便、易于保存等优点，现在在生产育苗饵料提供的环节中发挥着重大的作用。由研究结果显示3种的游离氨基酸含量各有不同，其中小球藻的非必需氨基酸总量显著高于浓缩小球藻和海洋红酵母（P<0.05），小球藻的非必需氨基酸含量是浓缩小球藻的1.20倍，是海洋红酵母的2.36倍，但浓缩小球藻的必需氨基酸含量显著高于其他两种饵料（P<0.05），浓缩小球藻的必需氨基酸含量是小球藻的2.03倍，是海洋红酵母的2.43倍，其中小球藻、浓缩小球藻的必需氨基酸以缬氨酸含量最高，是海洋红酵母的18倍和12.42倍，3种饵料的优势氨基酸各有不同。浓缩小球藻的脂肪酸含量显著低于小球藻，浓缩小球藻的饱和脂肪酸含量是小球藻的53.25%，不饱和脂肪酸含量是小球藻的67.31%，由此推测小球藻、浓缩小球藻的应用可以根据其实际生产应用进行适当的替代，但大量使用浓缩小球藻存在水质败坏、轮虫养殖密度低、活力差等生产实况，因此探寻浓缩小球藻在轮虫培养中使用的适宜用量，轮虫接种密度，水质调节，以及强化营养等问题都仍需不断的开展。

表4 5种轮虫的脂肪酸组成（%）Tab.4 Fatty acid composition of five group of rotifers(%)

3.2 海洋红酵母在轮虫培育上的应用前景

海洋红酵母是目前水产应用极具潜力的饵料蛋白原和微生物制剂[14-15]，富含氨基酸、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素以及促进各种海洋生物生长的多肽、肝糖、生长因子等[16-18]，这也与本研究的结果一致，海洋红酵母以精氨酸含量最高，是小球藻3.41倍，浓缩小球藻的79.86倍。3种饵料的不饱和脂肪酸含量以海洋红酵母为最高，海洋红酵母的顺式油酸含量是小球藻和浓缩小球藻的14.1倍，顺式亚油酸是小球藻和浓缩小球藻的7.11和6.96倍。现有研究表明海洋红酵母轮虫营养价值优于面包酵母轮虫[19-23]，且海洋红酵母的生长环境是海水，抗逆性较强，耐盐性好，不存在海水中易分解的现象，由此能缓解水质败坏，轮虫死亡的问题。本研究结果表明不同饵料培养的轮虫的氨基酸含量以小球藻+海洋红酵母为最高，最低为浓缩小球藻。其中小球藻+海洋红酵母组的必需氨基酸含量是海洋红酵母组的6.60倍，小球藻4.48倍，浓缩小球藻+海洋红酵母组的必需氨基酸含量是海洋红酵母组的1.07倍，浓缩小球藻3.51倍。可见海洋红酵母搭配小球藻或浓缩小球藻能显著提升轮虫的营养价值。5个试验组中，轮虫的EPA含量依次是N>N+H>X> X+H>H，DHA含量依次为X>X+H>H>N+H>N，可见混合组对轮虫的高度不饱和脂肪酸的提高作用欠佳。这可能与试验设计中各种饵料的品种、搭配、饵料配比以及轮虫密度等有关系。

[1]张雅芝,谢仰杰,胡家财,等.不同饵料和接种密度对褶皱臂尾轮虫种群增长的影响[J].集美大学学报:自然科学版,2005, 10(1):1-7.

[2]王鸿鹄,吴灶和,廖永岩.用酵母高密度培育褶皱臂尾轮虫[J].水产科学,2009,28(4):225-228.

[3]廖永岩,赵丽梅.在人工海水条件下,利用面包酵母培养褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)的研究[J].福建水产,2000(2): 1-8.

[4]王金秋,李德尚.酵母及与藻类搭配对萼花臂尾轮虫饵料效果的研究[J].应用生态学报,1998,9(3):78-81.

[5]王金秋,潘连德,郭 新,等.酵母及藻类对褶皱臂尾轮虫培养效果的比较研究[J].水产科技情报,2002,29(3):99-102.

[6]王金秋,李德尚,曹吉祥,等.5种藻和2种酵母对萼花臂尾轮虫饵料效果的比较研究[J].水生生物学报,2003,27(5):476-486.

[7]夏连军,黄宁宇,陆建学,等.褶皱臂尾轮虫的干酵母工厂化培养技术[J].水产科技情报,2004,31(6):270-272.

[8]陆建学，夏连军，周 凯.轮虫营养强化研究进展[J].现代渔业信息,2007,22(2):27-29.

[9]LE CRONE D,LOWE-MCCONNELL R H.The functioning of fresh water ecosystems[M].London:Combridge University Press, 1980:330.

[10]魏国重.刺参工厂化育苗的关键技术[J].水产养殖,2008,29(1):24-26.

[11]刘 青.日本高密度培养轮虫的现状与展望[J].大连水产学院学报,2007,22(4):299-305.

[12]陈学豪,吴钟强.小球藻营养液投喂轮虫效果的研究[J].福建农业学报,2005,20(sl):21-24.

[13]何进金,韦信敏,齐秋贞,等.若干因素对轮虫的繁殖影响[J].水产科技情报,1981(5):10-12.

[14]ALLEN N H,AHEARN D C.Ecology of aquatic yeasts[M]//ROSE A H,HARRISON J S,eds.The Yeasts,1987(2):181-205.

[15]刘秀莲,王宇光.海洋红酵母的研究进展[J].生物技术通讯,2008,19(2):293-295.

[16]王岁楼.食品生物技术[M].北京:中国海洋出版社,1998.

[17]MISAWA N,SHIMADA H.Metabolic engineering for the production of carotenoids in non-carotenogenic bacteria and yeasts [J].Biotechnology,1998,59:169-181.

[18]王宇光,雷禄旺,刘秀莲,等.海南海域海洋红酵母的分离鉴定和应用性能评价[J].中国农学通报,2009,25(22):324-328.

[19]陆建明,杨家新,吴学军,等.微藻及酵母强化轮虫对河蟹蚤状幼体的影响[J].水利渔业,2004,24(6):69-70.

[20]王渊良,邹月娥.酵母与藻类对养殖之海水壶轮虫成长及生化组成影响[J].养鱼世界,1993(5):23-27.

[21]陈 炜,王 鑫,童圣英,等.海洋酵母培养褶皱臂尾轮虫的脂肪酸组成研究[J].水产科学,2001,20(3):3-6.

[22]SATUITO C G,HIRAYAMA K.Nutritional quality of two species of marine yeasts(Candida sp＆Saccharomyces sp)on the population growth of the rotifer Brachionus plicatilis[C]//HIRANO R,HANYU I,eds.The Second Asian Fisheries Forum.Asian Fisheri Society,Marula,Philippines,1990:353-356.

[23]JAMES C M,DIAS P,SALMAN A E．The use of marine yeast(Candida sp.)and bakers’yeast(Saccharomyces cerealsiae)in combination with Chlorella sp for mass culture of the rotifer Brachionus plicatilis[J].Hydrobiologia,1987,147:263-268.

The Effect of Amino Acids,Fatty Acid Composition of Different Bait on Brachionus plicatilis

FU Rong-bin1,2,ZHANG Xia2,XU Zhi-jin2,et al
(1.Ningbo University,Ningbo 315211;2.Zhoushan Fisheried Research Institute of Zhejiang Provinnce,Zhoushan 316000,China)

To explore the feasibility of the Rhodotorula benthica and concentrated chlorella as cultivating bait of rotifers,using three different bait(chlorella,concentrated chlorella,R.benthica)alone or mixed to feeding of rotifers,and determination of two indicators-amino acids,fatty acids the three kinds of bait and different experimental rotifers,which is used to compare and evaluate nutritional value of different bait for Brachionus plicatilis.Results showed that non-essential amino acid of chlorella was more than the other two bait(P<0.05). Concentrated chlorella had the highest content of essential amino acids in the three kinds bait.The saturated fatty acid content of chlorella was significantly higher than the other two biological bait(P<0.05).Total unsaturated fatty acid content of R.benthica was the highest.Vaccwnate content of R.benthica was 14.1 times thatof chlorella and concentrated chlorella’s.Linoleate content was 7.11 times of chlorella and 6.96 times of concentrated chlorella.Comparison results of amino acids,fatty acids on different bait feeding rotifers showed that R.benthica matched two kinds of algae feeding the rotifers had obvious effect on improving essential aminoacid content of rotifers.However,it had less effect on improving fatty acid of rotifers.This research suggested that R.benthica and concentrated chlorella could serve as excellent rotifers which used to cultivate the bait.It could provide the reference for the nutrition of rotifers optimization and large-scale aquaculture technology development.

Brachionus plicatilis;Rhodotorula benthica;amino acid;fatty acid

S963.2

A

1008－830X(2016)05－0372－07

2016-06-30

海洋经济创新发展区域示范项目（浙海渔计〔2015〕29号）；舟山市公益类科技项目（2013C31047）；舟山市公益类科技项目（2015C31009）；浙江省公益技术研究农业项目（2015C32111）

傅荣兵（1971-），男，浙江舟山人，高级工程师，研究方向：水生动物增养殖.E-mail:853966748@qq.com

蒋霞敏，教授，博士生导师，研究方向：藻类克隆与饵料生物培养.E-mail:jiangxiamin@nbu.edu.cn