魏薇薇，姚利阳，曲有乐，闻正顺

（浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022）

微生物发酵鱿鱼加工副产物的工艺优化

魏薇薇，姚利阳，曲有乐，闻正顺

（浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022）

试验以鱿鱼加工副产物为主要原料，辅以龙须菜，进行酵母菌、保加利亚乳杆菌发酵。以可溶性蛋白转化率为检测指标，通过单因素和正交试验确定发酵的最佳条件。结果表明：（1）酵母菌发酵的最佳条件为：料水比为1∶7，碳源添加量为10%，接种量为15%，发酵时间为1 d，可溶性蛋白转化率最高为17.56%；（2）保加利亚乳杆菌发酵的最佳条件为：料水比为1∶7，碳源添加量为12%，接种量为5%，发酵时间为2 d，可溶性蛋白转化率最高为27.78%。通过微生物发酵,不仅解决了鱿鱼加工副产物的环境污染及资源浪费问题，而且还提高了鱿鱼加工副产物中小分子蛋白的含量，有望进一步加工成为利于消化吸收的理想生物制品。

鱿鱼；副产物；酵母菌；保加利亚乳杆菌；发酵

Key words:squid;byproduct;yeast;Lactobacillus bulgaricus;fermentation

在人类文明的历史上，发酵的应用可谓历史悠久，一方面，通过微生物发酵，食物的保质期可以延长；另一方面，发酵作用还能够使食物的感官品质及营养价值得以提高[1-3]。酵母是一种单细胞微生物，其存在于整个自然界中，但肉眼无法看到，它是一种天然的发酵剂。研究表明，酵母能将糖发酵成酒精以及二氧化碳[4]，它作为一种兼性厌氧微生物，有着独特的生命现象，即酵母在没有氧气或者有氧气的发酵条件下都能够存活[5]。酵母菌和系统的分类单元不一样，它是一类真核单细胞微生物的统称。酵母菌属于真菌属高等微生物，它具有分化的核膜及核仁，在其细胞内有像线粒体等相对复杂的结构[5]。酵母菌多分布在偏酸性（pH 4.5～6）及含糖量较高的环境里，其中大多数酵母菌为腐生生物，酵母菌在蔬菜表面、水果表皮及植物的叶子上分布比较广泛，特别实在菜园、果园和葡萄园的土壤当中分布更多[6]。在人类食品工业文化不断发展的进程中，酵母菌占据着及其重要的地位，起了不可替代的作用。目前，我们已经通过酵母菌生产出了各种各样营养丰富的饮品及食物，如今这些食物几乎可以说是我们餐桌上必不可少的东西，例如醋、面粉制品、酱油、各种酒类以及低醇类饮品[7-11]等。

保加利亚乳杆菌Lactobacillus bulgaricus，一种以国名称之的细菌，在1919年它被称为保加利亚嗜热菌Thermobacterium bulgaricus，后来1971年又被改为乳杆菌保加利亚，之后1984年又附属于德氏乳杆菌Lb.delbrueckii，称作德氏乳杆菌保加利亚亚种Lb.delbrueckii subsp.bulgaricus，可以看出它是典型的来自乳的乳酸菌。保加利亚乳杆菌是乳酸菌的重要组成部分，它作为一种发酵剂，广泛应用于食品工业中酸奶的生产当中。

随着人们对肠道微生物与健康关系的认识及研究不断加深，另外还有悉生生物学、临床医学、微生物学以及食品科学[12]之间的相互渗透，使得保加利亚乳杆菌这种益生菌逐渐被人们了解和关注。保加利亚乳杆菌特殊的生理活性曾被人们广泛地研究，主要是以发酵食品和微生态制剂[13-14]等多种形式出现。保加利亚乳杆菌能促进人体内有益菌的生长定植，可以清肠、抗腹泻等，从而维持胃肠道健康[15-17]，还具有促进消化吸收[18]、增加免疫[19]以及抗癌抗肿瘤[20-21]等重要的生理功能，因此，保加利亚乳杆菌被规定成为能够用于保健食品的益生菌菌种之一，并且其在饲料行业、食品发酵、工业乳酸发酵以及医疗保健领域都有广泛地应用。

鱿鱼副产物是鱿鱼在加工生产的过程中产生的废弃物，包括鱼头、鱼骨、鱼皮、内脏、鱼尾等，其重量约占原料鱼的20%～40%。副产物中含有丰富的蛋白质、维生素、不饱和脂肪酸及各种矿物质等多种成分[22]，如果不对其进行有效利用，将会是宝贵资源的极大浪费。因此，充分利用鱼类加工副产物，不仅能提高鱼类产品的附加值，而且在减少加工业污染物排放、保护环境等方面均具有重要的现实意义[23-25]。本文以鱿鱼加工副产物为发酵基质，结合酵母菌发酵和保加利亚乳杆菌发酵技术，以期提高鱿鱼副产物蛋白的利用价值，在研究发酵影响因素的基础上，对发酵工艺条件进行优化，分析发酵前后可溶性蛋白含量的变化及其蛋白转化率的高低，旨在为鱿鱼加工副产物后续的新型应用以及酵母菌发酵水产动物蛋白研究、保加利亚乳杆菌发酵水产动物蛋白研究提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 酵母菌纯菌种与培养基

酵母菌是湖北宜昌安琪酵母有限公司提供的，使用了两种培养基进行培养，一种是完全培养基（用于酵母菌的活化和培养），其培养基组成包括蔗糖、硝酸钠、磷酸氢二钾、氯化钾、7水合硫酸镁、硫酸亚铁、三蒸水（以上试剂均为分析纯）；另一种是发酵培养基（用于鱿鱼副产物的发酵试验），其培养基组成主要包括鱿鱼加工副产物、水、碳源。

1.1.2 保加利亚乳杆菌菌种与培养基

乳酸菌是湖北宜昌安琪酵母有限公司提供的，该乳酸菌是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌，我们又进一步筛选分离的，分离出的保加利亚乳杆菌进行了试验，试验所用的乳酸菌使用了两种培养基进行培养，一种是完全培养基，其培养基组成包括牛肉浸膏、酵母浸膏、葡萄糖、柠檬酸三胺、七水硫酸镁（以上试剂均为分析纯）；另一种是发酵培养基（用于鱿鱼加工副产物的发酵试验），其培养基组成主要包括鱿鱼加工副产物、水、碳源。

1.1.3 主要原辅料

鱿鱼加工副产物、葡萄糖、海藻粉（龙须菜粉末）、碳酸钠、氢氧化钠、无水硫酸铜、酒石酸钾等。

1.2 仪器与设备

THZ-82B气浴恒温震荡器金坛市医疗仪器厂；UV-1600型紫外分光光度计上海美谱达仪器有限公司；YC-260L 4℃冰箱；FA1004N分析天平上海民桥精密科学仪器有限公司；WF-180E超声波清洗机宁波海曙五方超声设备有限公司；HH-2数显恒温水浴锅国华电器有限；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂；DGG-9140A型电热鼓风恒温干燥箱上海森信实验仪器有限公司；TD5K离心机；DHS-20A卤素水分测定仪上海菁海仪器有限公司；KJELTECTM8400全自动凯氏定氮仪Made in Sweden等。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化

将酵母菌菌种和乳酸菌菌种分别接种到液体培养基中，接种后的各培养液在震荡培养箱中120 r/min、28℃培养24 h后，得到初始菌液。

1.3.2 发酵工艺

将鱿鱼加工副产物清洗干净，沥水30 min，用匀浆机打碎。精密称取2.0 g副产物匀浆，置于50 mL离心管，加入一定量的水和海藻粉。将活化后的种子培养液（调节菌数目为107）50 mL离心管，置于气浴震荡培养箱110 r/min发酵培养。

1.3.3 发酵温度的确定

按l0%接种量将菌液接种至液体种子培养基中，分别于20，24，28，32，34，50℃，110 r/min摇床培养24 h，以未接种的液体培养基为对照，测定接种的液体培养基在750 nm处的OD值，确定酵母菌和保加利亚乳杆菌的最适生长温度。

1.3.4 单因素试验

分别进行料水比（a:b，鱿鱼副产物：水）、碳源添加量（a:c，鱿鱼副产物：海藻粉）、接种量（d:b，活化菌液水）及发酵时间[26]对发酵产物可溶性蛋白转化率的影响试验。

1.3.5 正交试验设计

以料水比、碳源添加量、接种量及发酵时间4个因素为变量，设计4因素3水平正交试验，正交试验设计见表1。

表1 正交试验设计Tab.1 Orthogonal experimental design

1.4 检测指标及方法

1.4.1 可溶性蛋白含量测定

发酵前后物质的可溶性蛋白含量采用福林酚法[27]进行测量。

1.4.2 发酵蛋白转化率测定

发酵蛋白转化率测定结果根据以下公式获得：

式中X：蛋白转化率；M：发酵后可溶性蛋白含量；N：发酵前可溶性蛋白含量；P：鱿鱼副产物总蛋白含量。

2 结果与讨论

2.1 发酵温度优化

从图1和图2可以看出，对于酵母菌来说，它的适应温度范围较广，在24～34℃之间均可正常生长，28和32℃OD值相差不大，可以定为酵母菌的最佳发酵温度；对于保加利亚乳杆菌来说，在28℃的OD值最高，为其最佳发酵温度。综合酵母菌和保加利亚乳杆菌的最佳发酵温度，将温度定为28℃。

图1 不同温度下酵母菌的生长情况Fig.1 The growth of yeast at different temperature

图2 不同温度下保加利亚乳杆菌的生长情况Fig.2 The growth of lactobacillus bulgaricustat different temperature

2.2 酵母菌单因素及正交试验结果

2.2.1 酵母菌单因素试验结果

在海藻粉含量为5%，接种量为10%，发酵温度为28℃，发酵时间1 d的条件下，料水比分别为1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶10，进行发酵，结果如图3。从图3可以看出，当料水比为1∶7和1∶10时，酵母菌发酵产物的蛋白转化率较高，综合考虑，料水比选择1∶7较好。

图3 料水比对酵母菌发酵蛋白转化率的影响Fig.3 Effect of the ratio of material to water on protein conversion rate with yeast fermentation

在料水比为1∶5，接种量为10%，发酵温度为28℃，发酵时间1d的条件下，碳源添加量分别为2%、5%、7%、10%、12%，进行发酵，结果如图4。从图4可以看出，当碳源添加量为10%和12%时，酵母菌发酵产物的蛋白转化率变化相差不大，二者均可。

图4 碳源添加量对酵母菌发酵蛋白转化率的影响Fig.4 Effect of the addition of carbon source on protein conversion rate with yeast

在海藻粉含量为5%，料水比为1∶5，发酵温度为28℃，发酵时间1 d的条件下，接种量分别为5%、7%、10%、12%、15%，进行发酵，结果如图5。从图5可以看出，当接种量在上升的同时，酵母菌发酵产物的蛋白转化率先是上升，在接种量达到12%后，蛋白转化率先是下降，再上升。可能原因是，酵母菌在达到一定数量的时候，出现竞争生长，将发酵后小分子蛋白利用较多，故其蛋白转化率下降。

在海藻粉含量为5%，料水比为1∶5，接种量为10%，发酵温度为28℃条件下，发酵时间分别为1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，进行发酵，结果如图6。从图6可以看出，当发酵时间为1 d，酵母菌发酵产物的蛋白转化率最高。

图5 接种量对酵母菌发酵蛋白转化率的影响Fig.5 Effect of the Inoculation amount on protein conversion rate with yeast fermentation

图6 发酵时间对酵母菌发酵蛋白转化率的影响Fig.6 Effect of the fermentation time on protein conversion rate with yeast fermentation

2.2.2 酵母菌正交试验结果

在单因素试验的基础上，选择料水比、碳源添加量、接种量、发酵时间4个因素，进行3因素4水平的正交试验，结果见表2。由表2可知：根据极差R分析，蛋白转化率影响因素主次顺序为：料水比>接种量>发酵时间>碳源添加量，即料水比是影响酵母菌发酵蛋白转化率的重要因素，其次是接种量和发酵时间。最优组合为A3，B2，C3，D1，即发酵的最佳条件：料水比为1:7，碳源添加量为10%，接种量为15%，发酵时间为1 d。

表2 酵母菌发酵工艺正交试验设计与结果Tab.2 Orthogonal experiment design and results of yeast fermentation process

2.3 保加利亚乳杆菌单因素及正交试验结果

2.3.1 保加利亚乳杆菌单因素试验结果

在海藻粉含量为5%，接种量为10%，发酵温度为28℃，发酵时间1 d的条件下，料水比分别为1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶10，进行发酵，结果如图7。从图7可以看出，当料水比在由1∶1升到1∶10的过程中，保加利亚乳杆菌发酵产物的蛋白转化率先是快速提高，后增长缓慢。可能原因是，随着料水比的增加，菌浓度随之改变，当菌浓度小于某一个值时，其发酵速度受到影响。最佳的料水比为1∶7。

在料水比为1∶5，接种量为10%，发酵温度为28℃，发酵时间1 d的条件下，碳源添加量分别为2%、5%、7%、10%、12%，进行发酵，结果如图8。从图8可以看出，当碳源添加量为10%时，保加利亚乳杆菌发酵产物的蛋白转化率最高。可是在碳源添加量为12%时，蛋白转化率不升反降，可能原因是碳氮比的失衡影响了保加利亚乳杆菌的是生长速度。

图7 料水比对保加利亚乳杆菌发酵蛋白转化率的影响Fig.7 Effect of the ratio of material to water on protein conversion rate with Lb.bulgaricus fermentation

图8 碳源添加对保加利亚乳杆菌发酵蛋白转化率的影响Fig.8 Effect of the addition of carbon source on protein conversion rate with Lb.bulgaricus fermentation

在海藻粉含量为5%，料水比为1∶5，发酵温度为28℃，发酵时间1 d的条件下，接种量分别为5%、7%、10%、12%、15%，进行发酵，结果如图9。从图9可以看出，当接种量为10%、12%和15%时，保加利亚乳杆菌发酵产物的蛋白转化率相差不大，但在15%时，其蛋白转化率达到最高。最佳接种量为15%。

图9 接种量对保加利亚乳杆菌发酵蛋白转化率的影响Fig.9 Effect of the Inoculation amount on protein conversion rate with Lb.bulgaricus fermentation

在海藻粉含量为5%，料水比为1∶5，接种量为10%，发酵温度为28℃条件下，发酵时间分别为1 d、2 d、3 d、4 d、5 d，进行发酵，结果如图10。从图10可以看出，当发酵时间为2 d时，保加利亚乳杆菌发酵产物的蛋白转化率最高。

图10 发酵时间对保加利亚乳杆菌发酵蛋白转化率的影响Fig.10 Effect of the time on protein conversion rate with Lb. bulgaricus fermentation

2.3.2 保加利亚乳杆菌正交试验结果

在单因素试验的基础上，选择料水比、碳源添加量、接种量、发酵时间4个因素，进行3因素4水平的正交试验，结果见表3。由表3可以看出：根据极差R分析，蛋白转化率影响因素主次顺序为：料水比>碳源添加量>接种量>发酵时间，即料水比是影响保加利亚乳杆菌发酵蛋白转化率的重要因素，其次是碳源添加量和接种量。最优组合为A3，B3，C1，D2，即发酵的最佳条件：料水比为1∶7，碳源添加量为12%，接种量为5%，发酵时间为2 d。

表3 保加利亚乳杆菌发酵工艺正交试验设计与结果Tab.3 The design and results of orthogonal experiment in the fermentation process of Lb.bulgaricus

2.4 讨论

通过对酵母菌和保加利亚乳杆菌的单因素和正交试验结果的进一步分析，发现酵母菌发酵产物蛋白转化率可达到17.56%，而保加利亚乳杆菌发酵产物蛋白转化率则高达27.78%，显然乳酸菌发酵鱿鱼加工副产物的效果好于酵母菌。这可能和乳酸菌特有的某些功能有关，例如乳酸菌[28]在发酵过程中能合成各种维生素，其中B族维生素含量明显增加。乳酸菌发酵鱿鱼加工副产物过程中具体什么因素提高了发酵产物的蛋白转化率还有待进一步研究。已有研究表明，将植物性蛋白和水产动物按一定比例混合进行发酵，可以减少甚至消除植物性蛋白中限制性氨基酸对动物的影响，进而可以使氨基酸含量得以平衡，把发酵产物进一步加工成饲料，其应用价值很大完全有可能替代某些水产饲料中的鱼粉[29]。微生物发酵的过程中产酶，并且降解鱿鱼加工副产物中的大分子蛋白是个复杂的过程，此外通过微生物发酵其发酵产物中氨基酸是如何改善的也需要进一步研究。

3 结论

（1）通过单因素和正交试验确定了酵母菌发酵鱿鱼加工副产物的最佳条件：料水比为1:7，碳源添加量为10%，接种量为15%，发酵时间为1 d。在此条件下，酵母菌发酵蛋白转化率最高为17.56%。

（2）通过单因素和正交试验确定了保加利亚乳杆菌发酵鱿鱼加工副产物的最佳条件：料水比为1:7，碳源添加量为12%，接种量为5%，发酵时间为2 d。在此条件下，保加利亚乳杆菌发酵蛋白转化率最高为27.78%。

[1]FRIAS J,MIRANDA M L,DOBLADO R,et al.Effect of germination and fermentation on the antioxidant vitamin content and antioxidant capacity of Lupinus albus L.var.Multolupa[J].Food Chemistry,2005,92(2):211-220.

[2]HUR S J,LEE S Y,KIM Y C,et al.Effect of fermentation on the antioxidant activity in plant-based foods[J].Food Chemistry,2014, 160:346-356.

[3]LIMON R I,PENAS E,TORINO M I,et al.Fermentation enhances the content of bioactive compounds in kidney bean extracts [J].Food Chemistry,2015,172:343-352.

[4]王晓宏,刘大程,殷兆丽,等.复合酵母培养物对奶牛生产性能的影响[J].饲料工业,2010(10):37-38.

[5]孙万儒.酵母菌[J].生物学通报,2007,42(11):5-10.

[6]刘志恒.现代微生物学[M].北京:科学出版社,2004.

[7]王国良,宋俊梅,曲静然.生香酵母及其应用[J].食品工业,2004(3):16-17.

[8]韩珊珊.柠檬形克勒克酵母在葡萄酒发酵中的应用研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2008.

[9]王国良,宋俊梅,曲静然.生香酵母及其应用[J].食品工业,2004(3):16-17.

[10]杨国军.低度保健型黄酒的研制开发[J].酿酒,2001,28(3):81-82.

[11]张澎湃,杨生玉.产酯酵母在黄酒生产中的应用及增香降度研究[J].食品科技,2005(7):66-68.

[12]康明丽.乳酸菌及其在食品工业中的应用[J].河北工业科技,2008,25(6):391-393.

[13]吕嘉枥,张淑娟,董云森,等.乳酸菌抗湿热保护剂的研究[J].西北轻工业学院学报,2002,20(4):29-33.

[14]邢美孜.利用德氏保加利亚乳杆菌发酵脱脂乳生产生物活性肽及其体外生理功能初步研究[D].上海:上海交通大学,2006.

[15]余 瑛,张 娅,刘 锐,等.不同乳杆菌对常见病原菌的抑菌效果研究[J].西南农业学报,2006,19(2):294-296.

[16]刘 洁,史贤明.两种乳酸菌及其发酵液对单核细胞增生李斯特菌生长的抑制作用[J].上海交通大学学报:农业科学版, 2006,24(3):221-225.

[17]王小红,谢笔钧,史贤明,等.乳酸菌对金黄色葡萄球菌生物拮抗作用的初步研究[J].食品工业科技,2005,26(1):68-73.

[18]张兰威.乳与乳制品工艺学[M].北京:中国农业出版社,2006:206-207.

[19]刘文群,邓泽元,徐尔尼,等.保加利亚乳杆菌对微量元素硒铬、锌的富集[J].食品科技.2006(2):135-137.

[20]刘 宇.保加利亚乳杆菌胞外多糖诱导人胃癌细胞凋亡的作用与机制[D].哈尔滨:东北农业大学,2007.

[21]张 筠,刘 宁,孟祥晨.保加利亚乳杆菌胞外多糖对人癌细胞抑制作用的研究[J].中华预防医学杂志.2007(3):238-239.

[22]陈国章,谢 超.带鱼下脚料水解螯合物制备及生物特性研究[J].浙江海洋学院学报：自然科学版,2010,29(1):49-54.

[23]BHASKAR N,BENILA T,RADHA C,et al.Optimization of zymatic hydrolysis of visceral waste proteins of Catla(Catla catla) for preparing protein hydrolysate using a commercial pro-tease[J].Bioresource Technology,2008,99(2):335-343.

[24]BENHABILES M S,ABDI N,DROUICHE N.Fish protein hy-drolysate production from sardine solid waste by crude pepsin enzymatic hydrolysis in a bioreactor coupled to an ultrafiltra-tion unit[J].Materials Science and Engineering:C,2012,32(4): 922-928.

[25]DUAN Rui,ZHANG Jun-jie,DU Xiu-qiao.Properties of collagen from skin,scale and bone of carp(Cyprinus carpio)[J].Food Chemistry,2009(112):702-706.

[26]夏 宇,卢笑莹,杨益波,等.枯草芽孢杆菌转化鱿鱼墨制备溶栓型发酵液[J].浙江海洋学院学报：自然科学版,2012,31(6): 509-512.

[27]陈 荫.四株不同来源海洋微生物胞外多糖的结构及抗氧化活性研究[D].青岛:中国海洋大学,2012.

[28]中华人民共和国卫生部.GB 19302-2010食品安全国家标准发酵乳[S].北京:中国标准出版社,2010.

[29]刘 勇,冷向军,李小勤.发酵蛋白在水产饲料中的研究应用[J].上海海洋大学学报,2009,18(1):101-106.

Optimization of Fermentation Conditions of Squid Processing Byproduct by Microbe

WEI Wei-wei,YAO Li-yang,QU You-le,et al
（School of Food and Medical of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

The fermentation was produced by Yeast and Lactobacillus bulgaricus with squid processing byproduct as the main raw material,supplemented with Seaweed powder.The optimal conditions of fermentation were determined by single factor and orthogonal experiment with the conversion ratio of soluble protein for index.Results show:(1)the optimal conditions for the fermentation of yeast were as follows:the ratio of material to water was 1:7,the added amount of carbon source was 10%,the inoculation amount was 15%,the fermentation time was 1 d,the conversion ratio of soluble protein was 17.56%;(2)the optimal conditions for the fermentation of L.bulgaricus were as follows:the ratio of material to water was 1:7,the added amount of carbon source was 12%,the inoculation amount was 5%,the fermentation time was 2 d,the conversion ratio of soluble protein was 27.78%.By microbial fermentation,which not only solves the environmental pollution and resources waste problems of the by-products from processing of squid,but also improve the contents of small molecular proteins in processing byproducts of squid.Microbial fermentation product is expected to be further processed to become the ideal biological products which are conducive to digestion and absorption.

TS254

A

1008－830X(2016)05－0410－07

2016-07-29

舟山市科技计划项目（2016-41015）

魏薇薇（1991-），女，江苏徐州人，硕士研究生，研究方向：海洋资源高值化利用.E-mail:1937676799@qq.com

闻正顺（1982-），男，副教授，研究方向：海洋资源高值化利用、海洋天然产物与健康.E-mail:zswenmr@163.com