程俊 曾晓荣 谭晓秋 李鹏云 文静 陈琳琳 杨艳

(西南医科大学心血管医学研究所 医学电生理教育部重点实验室，四川 泸州 646000)

论 著

一种改良的原代大鼠乳鼠心肌细胞分离及培养方法*

程俊 曾晓荣 谭晓秋 李鹏云 文静 陈琳琳 杨艳△

(西南医科大学心血管医学研究所 医学电生理教育部重点实验室，四川 泸州 646000)

目的：本研究旨在探讨一种经改良后既稳定又高效的分离大鼠乳鼠心肌细胞的原代分离和培养方法，拟建立此种方法，为进一步研究单个心肌细胞上的各种电生理机制等诸多实验提供有利的前提保障。方法：取出生1-3天内SD大鼠心脏，联合应用胰蛋白酶和Ⅱ胶原酶两步消化，离心收集到心肌细胞，差速培养，加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷纯化后得到原代心肌细胞，经高糖DMEM培养，即可得到立体感较强的大鼠乳鼠心肌细胞。结果：联合应用胰蛋白酶和Ⅱ胶原酶两步消化，经过高糖DMEM培养后得到的心肌细胞存活率高、纯度高、折光性好、立体感较强，有节律性搏动。结论：成功建立了一种既简便高效又稳定的分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法，为今后研究乳鼠心肌细胞的功能及其基本电生理特性提供良好的单个细胞，可广泛应用于各种心血管疾病的研究中。

乳鼠；心肌细胞

在心血管疾病的临床和基础研究中，大鼠乳鼠心肌细胞常常被用作细胞体外实验的研究模型。虽然Harary等[1]早在1960年就已经找到原代乳鼠心肌细胞分离及培养方法，但用这种传统方法所分离的乳鼠心肌细胞的存活率低、纯度不高，不能广泛应用于心血管疾病的基础性研究。经过几十年的探索和发现，人们不断改良方法，力求寻到更适合的乳鼠心肌细胞分离方法，当前很多文献报道的培养方法大多数都是在传统方法基础上进行改良[2-10]，总结起来主要有两种方法，胰蛋白酶消化法、胰蛋白酶和胶原酶混合消化法两种，但是这两种方法都存在一些问题，因此为了得到纯度及活力更高的乳鼠心肌细胞用于心血管疾病的研究，本研究将对传统分离法改进，探索出一种有效而实用的原代乳鼠心肌细胞分离培养的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

主要试剂胰蛋白酶(HyClone)，II型胶原酶(Sigma)、高糖DMEM(HyClone)、胎牛血清(HyClone)、5-Brdu(5-溴脱氧尿苷)(上海浩然生物技术有限公司)。

消化酶的配制胰蛋白酶为0.25%，胶原酶溶液由II型胶原酶、小牛血清白蛋白、DMEM培养基按1：5：1组成。

实验动物新生SD大鼠乳鼠(1-3 d)，由西南医科大学实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠乳鼠心肌细胞分离

PBS 15 mL加入P10培养皿，共三枚。取新生SD大鼠浸泡于装有75%酒精烧杯中进行消毒，时间1 min。四肢固定后，用镊子从剑突下方成V字剪开皮肤，肋弓正中偏左开胸，从心底部夹取心脏，放入盛有4℃ PBS的P10培养皿中，轻微挤压，排除血液。冲洗后的心脏移至新的培养皿中，在放大镜下找到左右心耳和左右心室，用镊子夹取，PBS清洗2次收集至玻璃培养瓶中，加入0.25%胰蛋白酶3 mL，4 ℃静置过夜。12-16 h后，再向装有心脏的消化瓶中加入10%胎牛血清的DMEM培养基3 mL，37℃恒温水浴箱5 min终止消化。弃上清，加入胶原酶溶液3 mL，置于37℃恒温水浴箱，1 min用手轻摇，首次消化，消化液中含有较多红细胞等杂质。弃上清，加入胶原酶溶液4 mL，置于37℃恒温水浴箱，10 min用手轻摇。收集上清移入新的10 mL离心管中。向残留的组织中加入胶原酶溶液4 mL，37 ℃恒温水浴箱中继续消化，消化10 min，收集上清液。可以根据心肌细胞块残留情况反复消化，使心肌组织得到充分的利用。将收集到得细胞上清液离心5 min(1000 r·min-1)，见细胞沉淀于试管底部。弃上清，加高糖DMEM培养基10 mL，轻轻拍打管壁使心肌细胞悬浮其中，而后均匀接种至P10的培养皿中。将培养皿放入37℃、含5%CO2的培养箱中培养70 min。倒置显微镜下观察，成纤维细胞折光性弱帖附于培养皿底部，心肌细胞折光性好处于悬浮状态，收集细胞悬液，计数后，均匀接种于6孔板中。如果倒置显微镜下观察发现有较多折光性好的心肌细胞残留可以用DMEM液轻柔冲洗培养皿底部，即使心肌细胞贴壁但是其贴壁程度明显低于成纤维细胞，轻柔冲洗可将心肌细胞脱离而不影响成纤维细胞。向培养基中加入5-Brdu(100:1)放入37℃、含5%CO2的培养箱中，培养24 h，5-Brdu可以抑制成纤维细胞的分裂。24 h后换液一次，观察细胞形态，贴壁以及搏动情况。

1.2.2 心肌细胞纯度鉴定

培养24 h后的心肌细胞用DAPI和а-SA单克隆抗体染色，DAPI染色细胞核后呈蓝色，а-SA单克隆抗体染色后呈绿色，并可观察到心肌具有明显的横纹，即为阳性心肌细胞。因此，我们在荧光显微镜下，放大倍数为10×10，随机观察5个视野，分别计数200个细胞，其中阳性心肌细胞占总细胞的百分比即为心肌细胞的纯度。

2 结果

2.1 细胞形态观察

刚刚分离下来的大鼠乳鼠心肌细胞在倒置相差显微镜下观察呈圆形或椭圆形，排列较紧密，培养12 h后心肌细胞开始贴壁，活力较好，培养24 h后细胞基本贴壁，较少细胞有自发性搏动，培养48 h后心肌细胞体积开始增大，基本都有自发性搏动，培养72 h后细胞伸出伪足，伪足之间相互接触，交织成网状，并有细胞集聚成簇，见图1。

图1 培养48 h后心肌细胞形态(10×4)

2.2 心肌细胞纯度鉴定

培养24 h后的心肌细胞经免疫荧光染色后，在荧光显微镜下观察，见图2。心肌细胞细胞核经DAPI染色后呈蓝色，经а-SA单克隆抗体染色后呈绿色，具有明显的横纹。计算出心肌细胞纯度为93.7%±1.6%。

A B C图2 免疫荧光结果(10×20)注：A为DAPI染色的心肌细胞细胞核，B为α-SA单克隆抗体染色，C为合成图。

3 讨论

心肌细胞的原代分离及培养是研究心血管疾病的基本方法和手段之一，能提供单一同源心肌细胞，而在制备细胞模型时对心肌细胞的数量、纯度和活性度都有较高的要求。而目前大多数文献报道的分离方法都是在单一酶法和混合酶法基础上改良而成，由于传统的单一胰酶消化法会过度消化心肌细胞，从而使分离下来的心肌细胞的存活率降低；而混合酶法因为酶的消化能力减弱而造成心肌组织消化的不完全，使心肌细胞的数目大大较少。从而我们根据实验要求和传统分离法存在的缺点，摸索出了一种稳定高效分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法。本实验选取新出生1-3天内的大鼠乳鼠的心脏，经胰蛋白酶和胶原酶混合，过夜，得到大量活性较高的心肌细胞。胰蛋白酶过夜消化，可以让胰蛋白酶充分缓慢作用于心肌组织，从而减轻胰蛋白酶作用过快对心肌细胞的损伤，更有利于保持心肌细胞的活性。胶原酶溶液是由II型胶原酶、小牛血清白蛋白以及培养基按照一定比例组成，这样可以缓解胶原酶的直接作用，使心肌细胞缓慢从心肌组织上松散下来，从而增加心肌细胞的活力度，多次反复消化组织，这样可以增加心肌细胞数量。心肌组织中有大量的成纤维细胞，为了减少成纤维细胞的影响，增加心肌细胞的纯度，我们采取了差速培养法，这样可以更好的将心肌细胞和成纤维细胞分离开，从而增加心肌细胞的纯度。即使这样，仍然有成纤维细胞的残留，因此，我们加入了成纤维细胞生长抑制剂5-Brdu，5-Brdu为核苷酸类似物，可在成纤维细胞复制时代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)阻断DNA复制而抑制成纤维细胞生长。而5-Brdu对心肌细胞几乎没有抑制作用[11]，这样大大提高了心肌细胞的纯度。

本研究探索的原代大鼠乳鼠心肌细胞培养方法，是一种高效而稳定的方法，运用此方法可以获得搏动良好、纯度较高的心肌细胞，虽然较以往的心肌细胞培养方法在操作上稍微复杂些，但是能得到较为理想的心肌细胞，完全能满足心血管疾病研究中对心肌细胞的实验要求。

1 Harary L, Farley B. In vitro studies of single isolated beating heart cells[J]. Science, 1960, 131(3414): 1674-1675.

2 张晓京,张建东,来丽娜,等. SD乳鼠原代心肌细胞培养方法的改进[J]. 长治医学院学报, 2012, 3(26): 171-173.

3 柳梅,张刚成,姚艺,等. 乳鼠心肌细胞的体外培养[J]. 临床和实验医学杂志, 2009, 1(8): 3-4.

4 张丽娜,金国琴,郭炜,等. 原代乳鼠心肌细胞的培养方法[J]. 中药药理与临床, 2010, 26(5): 148-150.

5 伍长学,范英,李新,等. 新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改进[J]. 泸州医学院学报, 2009, 1(32): 1-4.

6 张琳,李东野,王志荣,等. 新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良[J]. 徐州医学院学报, 2008, 28(5): 303-306.

7 李博,吴慧颖,朴虎林,等. 新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良[J]. 中国实验诊断学, 2012, 2(16): 200-203.

8 庞勇军,孙莉,谢文君,等. 新生大鼠心肌细胞分离、纯化及培养方法的改进[J]. 上海交通大学学报, 2014, 4(31): 520-523.

9 李志军,曹雪滨. 新生大鼠原代心肌细胞的培养[J]. 新乡医学院学报, 2012, 1(29): 11-17.

10陶静,马依彤,李晓梅,等. 原代乳鼠心肌细胞培养方法的改进[J]. 中华心血管病杂志, 2014, 42(1): 53-56.

11Simpson P, Savion S. Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol[J]. Circ Res,1982,50(1): 101-116.

An improved method of isolation and culture myocardial cells in neonatal rat*

Cheng Jun, Zeng Xiao-rong, Tan Xiao-qiu, Li Peng-yun, Wen Jing, Chen Lin-lin, Yang Yan△

(Key Laboratory of Medical Electrophysiology, Ministry of Education, and the Institute of Cardiovascular Research, South-West Medical University, Sichuan Luzhou 646000)

Objective：To investigate a stable and efficient isolation and culture rat myocardial cells in rat neonatal, to provide premise and guarantee for many experiments to study various kinds of electrophysiological mechanism on single myocardial cells. Methods: Rat myocardial cells were digested using two step method with trypsin and collagenase II in newborn SD rat aged 1-3 days. All collected myocardial cells were differential cultured, added 5-5-bromodeoxyuridine, and cultured in high glucose DMEM to get the strong three-dimensional sense of rat myocardial cells. Results: Myocardial cells with high survival rate, high purity, good refraction, good refraction,strong dimensional sense and rhythmic beat could be obtained after trypsin and collagenase digestion and high glucose DMEM cultivation. Conclusion: We have successfully established a simple effective and stable method for the isolation of neonatal rat cardiac muscle cells, which provides a good single cell for the future study of the function and basic electrophysiological properties of neonatal rat cardiac muscle cells, which can be widely used in various heart disease studies.

Neonatalrat; Cardiac muscle cells

国家自然科学基金资助项目(编号：81173661)，泸州市-泸州医学院联合专项(编号：2013LZLY-J49)

程俊，女，副研究员，主要从事心血管电生理研究，Email：lzcj1221@sina.com。

△通讯作者：杨艳，女，研究员，主要从事心肌电生理、药理学研究，Email：wyangyan@gmail.com。

2016-9-7)