陈信忠，郭书林，庞 林，龚艳清，王立生，罗 睿

（厦门出入境检验检疫局，福建厦门 361026）

罗非鱼湖病毒感染研究进展

陈信忠，郭书林，庞 林，龚艳清，王立生，罗 睿

（厦门出入境检验检疫局，福建厦门 361026）

罗非鱼是全球第二大重要养殖鱼类，也是我国重要的养殖和出口产品。本文介绍了罗非鱼湖病毒的病原学、流行病学（地理分布、易感动物、传播方式、季节性、发病率和死亡率、组织病理特征）以及部分诊断技术进展，以期为我国有效防控该病提供借鉴。

罗非鱼；罗非鱼湖病毒；病原；诊断技术；进展

Abstract：Tilapias is the second-most important farmed fish worldwide and also important aquaculture and export industry in China. The reasearch progress of the etiology，epidemiology（including geographical distribution，susceptible host species，transmission mechanisms，seasonality，morbidity and mortality，histopathological features）and some diagnostic techniques of the Tilapia lake virus（TiLV）were introduced in this paper，in order to provide reference for the disease prevention and control.

Key words：Tilapia；Tilapia Lake Virus；pathogen；diagnostic technique；progress

罗非鱼种类超过100种，因具有食性广、生长快、繁殖力强等优点，被许多国家引种养殖，成为全球仅次于鲤鱼的第二大重要鱼类，是很多发展中国家的主要食用蛋白质来源，也是许多渔民和养殖者的重要经济来源。2015年，全球罗非鱼产量约640万吨，产值超过98亿美元，国际贸易额超过18亿美元。全球十大罗非鱼生产国依次为中国、印度尼西亚、埃及、孟加拉、越南、菲律宾、巴西、泰国、哥伦比亚和乌干达。罗非鱼养殖已成为保障全球粮食安全和满足人类营养需求的重要产业[1]。从2009年开始，以色列、厄瓜多尔、埃及、泰国等国家先后暴发了罗非鱼湖病毒（Tilapia Lake Virus，TiLV）感染引起的传染病，导致大批野生和养殖罗非鱼死亡，造成严重的经济损失[2]。我国是罗非鱼养殖和出口大国，2015年罗非鱼养殖产量达到180万吨[1]，约占世界养殖罗非鱼总产量的二分之一。罗非鱼原产于非洲，为提高罗非鱼的品质，我国每年需要从国外引进优良的罗非鱼新品种，这存在着各种病原通过国际贸易传入的潜在风险。实际上，我国已经在海南省发现了TiLV感染[3]。目前，世界动物卫生组织（OIE）和我国都未将TiLV列入检疫名录，也无相应的检测方法。因此，了解TiLV的流行病学和诊断技术，对预防和控制这种外来病具有重要意义。

1 病原学

罗非鱼湖病毒病又称为罗非鱼合胞体肝炎（syncytical hepatitis of tilapia，SHT）[4]，病原TiLV为近年来新发现的病毒，其分类地位尚未被确认。根据其生物学特性，目前TiLV被归类为正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的一种新的病毒。电子显微镜显示病毒粒子为具包膜的二十面体结构，大小为55～75 nm。病毒对乙醚和氯仿敏感[2]。

Eyngor等[2]最先对以色列罗非鱼湖病毒病的暴发进行了研究，证明病原是一种新的RNA病毒，并参考病原的发现地点命名为罗非鱼湖病毒。由于TiLV是RNA病毒，容易发生变异，可能存在多个不同的地理株。截至目前，美国国家生物技术信息中心（Genbank）已收录了2株TiLV的全基因组序列，分别来自以色列分离的Til-4-2011毒株和泰国分离的TV1毒株。

Bacharach等[5]对以色列分离的Til-4-2011毒株进行了深入研究。TiLV为分段、单链的负链RNA病毒，由10个基因片段组成。每一个片段都有1个开放阅读框（ORF），编码10种蛋白。片段1最大，为1.641 KB，片段2～10分别为 1.471 KB、1.371 KB、1.250 KB、1.099 KB、1.044 KB、0.777 KB、0.657 KB、0.548 KB和0.465 KB。片段1预测蛋白与C型流感病毒的聚合酶基1（polymerase basic 1，PB1）亚基具有弱同源性（氨基酸同源性为17%，覆盖37%片段）。其他9个片段与Genbank其他序列无同源性。通过对5´和3´非编码区的核苷酸序列进行分析，所有片段在5´端的13个核苷酸和3´端的13个核苷酸都是相似的，这一结构与流感病毒类似。5´端的13个核苷酸中的10个和3´端13个核苷酸中的7个100%保守，其余核苷酸在片段5～9是保守的。核苷酸序列在5´端和3´端表现出互补特征。E-11细胞培养分离病毒的质谱图证实了片段2～10预测的ORF和编码的肽段。未检测到代表片段1的蛋白质序列。从片段5和片段6预测的ORF，分别在氨基酸25/26和30/31之间含有信号肽的切割位点。

Surachetpong等[6]报告了泰国TV1毒株的全基因组序列，还对其他6株病毒的PB1基因序列进行了分析。结果表明泰国毒株与毒株Til-4-2011的核苷酸和氨基酸具有较高同源性（95.18%～99.10%）。Dong等[7]的研究也表明TiLV泰国株与毒株Til-4-2011的核苷酸同源性为96.28%～97.52%，氨基酸同源性为97.35%～98.84%。厄瓜多尔的TiLV毒株与以色列株的核苷酸同源性为97.20%～99.00%，氨基酸同源性为98.70～100.00%[5]。埃及分离株与以色列毒株的同源性只有93.00%[8]。海南省发现的TiLV与GenBank中TiLV的基因同源性为96.00%[3]。

2 流行病学

2.1 地理分布

罗非鱼为热带鱼类，主要分布于热带、亚热带的淡水和半咸水水域。至今TiLV已确认在哥伦比亚、厄瓜多尔、以色列、埃及和泰国流行[5，8-10]。罗非鱼国际贸易十分频繁，包括亚洲、非洲、欧洲、北美洲和南美洲在内的43个国家已确认都曾经从TiLV感染的国家引进过罗非鱼[7]。因此，这些国家的养殖鱼类存在较高的TiLV感染风险。实际上，很多国家的养殖罗非鱼常暴发传染性疫病，由于多种原因并未对病原进行调查，无法排除发病罗非鱼是否也感染了TiLV，所以该病的实际地理分布可能要广泛得多。虽然我国至今尚无TiLV感染的确切报告，但已有海南省罗非鱼养殖场样品的PCR检测报告，结果表明TiLV感染为阳性[3]。

2.2 易感动物

至今只有罗非鱼被证明易感TiLV，而且几乎所有的罗非鱼物种均对TiLV易感。Eyngor等[2]调查了以色列基内雷特湖的27种野生的慈鲷科、鲤科、鼬科和鲷科鱼类，发现只有慈鲷科的罗非鱼类发病，并导致数量锐减，而其他鱼类均未出现临床症状和死亡。Surachetpong等[6]也证明TiLV只感染罗非鱼，不会感染其他水生或陆生动物。TiLV主要危害罗非鱼仔稚鱼和幼鱼，对成鱼影响相对较小，因此幼体阶段似乎比成鱼更易感[6-9]。由于缺乏其他动物易感性的信息，有可能还存在其他易感物种。在以色列暴发TiLV感染期间的共养实验表明，乌鱼（Mugil cephalus）和鲤鱼（Cyprinuscarpio）均不会发生死亡[2]。同样的，在埃及发病疫区共养的乌鱼和薄唇乌鱼（Liza ramada）也未发现感染[8]。已经有证据表明某些罗非鱼的遗传品系对TiLV具有一定抗性。Ferguson等[9]报告，一种罗非鱼品系的死亡率为10%～20%，明显低于其他品系的80%。

2.3 传播途径

至今尚不清楚TiLV的最初来源，野生或养殖的受TiLV感染的鱼群是目前已知的唯一传染源。有证据表明，病鱼的眼睛、大脑和肝脏常常含有高浓度的病毒，其肌肉组织也可能存在病毒。因此，发病死亡的罗非鱼可能是重要的病毒污染源。

TiLV可以通过混养进行水平传播。直接水平传播是其主要传播途径，罗非鱼的活体交易和运输最有可能传播疾病。至今尚无垂直传播的证据。Eyngor等[2]证明TiLV可以通过水体途径传播。由于TiLV的生物物理学特性尚不明确，很难评估通过污染物间接传播的意义。鸟类可能对TiLV的传播发挥一定的作用。Fathi等[8]研究表明，因为埃及与以色列接壤，TiLV可能通过鸟类迁徙等多种途径如从以色列传入埃及。以色列暴发TiLV感染以后，埃及的养殖罗非鱼也常常暴发“夏季死亡症”。不过，至今尚无直接证据能证明鸟类可以传播TiLV。

2.4 季节性

罗非鱼TiLV感染主要在高温季节暴发，但在热带地区可能全年均可感染。从2009年夏天开始，以色列全境出现罗非鱼大量死亡。通常在5—10月炎热时间发病，发病水温为22～32 ℃[2]。近年来，埃及罗非鱼不明原因死亡症的发病季节通常为6—10月，水温大于25 ℃[8]，厄瓜多尔主要在水温为25～27 ℃的5—11月[9]。此外，在泰国，10月到次年5月之间采集的部分样品TiLV检测结果为阳性[6]。

2.5 发病率和死亡率

不同种类的罗非鱼或不同生长阶段感染TiLV的发病率和死亡率差别明显。Eyngor等[2]报告，因为TiLV感染导致以色列加利略罗非鱼（Sarotherodon galilaeus）年产量从316吨（2005年）分别下降至51吨（2007年）、8吨（2009年）和45吨（2010年），其他野生罗非鱼如普通罗非鱼（Tilapia zilli）和约旦罗非鱼（Oreochromis aureus）等也大幅减产。健康的罗非鱼和病鱼混养，几天内死亡率达80%～100%证明该病传染性很强。

近年来，泰国养殖罗非鱼TiLV感染大部分发生在鱼苗转移到水库网箱或公共水域后1个月。大多数死亡发生在出现第一条死鱼后的2周内，死亡率约20%～90%[6]。厄瓜多尔的养殖罗非鱼也发生了类似的传染病，在转移到养殖池塘后4～7 d内出现发病死亡。不同品种罗非鱼的死亡率有较大差异，较低的为10%～20%，较高的可达80%[9]。埃及37%的罗非鱼渔场受到TiLV感染，平均死亡率为9.2%。从发生“夏季死亡症”的7个养殖场采集组织样本，其中3个养殖场的样品经过PCR检测显示TiLV为阳性[8]。Dong等[7]报道，放养1个月内的红罗非鱼鱼苗感染TiLV后死亡率可达90%。Tattiyapong等[11]在泰国进行了一项腹腔注射攻毒实验，感染4～12 d后尼罗罗非鱼和红罗非鱼的死亡率分别高达86%和66%，并表现出与自然感染相似的临床症状和病理变化。Eyngor等[2]发现养殖系统中罗非鱼群体经历发病事件后幸存的鱼对TiLV再次感染具有免疫力。

2.6 组织病理特征

泰国患病的鱼表现出食欲不振、嗜睡、行为异常、游动迟缓、体色苍白、贫血、眼球突出、腹部肿胀、皮肤充血和糜烂[6-7]。埃及的病鱼主要表现为体表出现出血斑、鱼鳞脱落、开放性伤口、体色变黑、鳍糜烂等[12]。肉眼病变主要表现为晶状体混浊，进而发展到晶状体破裂。其他病变包括皮肤糜烂、软脑膜出血、脾充血[2]。海南省罗非鱼的主要症状是鳃盖内缘出血，烂鳃，腹腔有腹水，肝脏和肾脏出血[3]。

不同地理株的组织病变有所差异，以色列毒株的病理变化主要在中枢神经系统，而南美洲毒株主要发生在肝脏[9]。大脑病变包括软脑膜水肿和局灶性出血，白质和灰质皮层的毛细血管充血，神经变性，胶质细胞增生，血管周围淋巴细胞浸润等。肝组织病变包括肝细胞肿胀和脱落，并表现出典型的合胞体肝炎特征[7]。脾肿大，淋巴细胞增生，肝脏和脾脏中的黑色素巨噬细胞中心（MMCs）数量增加。透射电镜证实肝细胞内存在正粘病毒样病毒[4]。泰国TiLV感染的临床症状和病理表现与以色列的TiLV感染相似。发病后，幸存的鱼很少出现临床症状，表明罗非鱼对该病毒具有特异性免疫功能[6]。Eyngor等[2]用纯化的TiLV腹腔注射感染罗非鱼，可以引发类似自然疾病的症状和病理变化，死亡率大于80%。

3 诊断技术

TiLV是近年来出现的急性传染性病原。国外已经在病毒的细胞培养、组织病理学、PCR、原位杂交等检测技术方面进行了研究，并建立了相应的检测方法。因为分子生物学方法具有快速、灵敏、简便的特点，大多数国家都采用PCR技术对TiLV进行监测和诊断。国内针对TiLV的研究几乎是空白。很多罗非鱼疫病的病因未能彻底调查，无法明确TiLV在我国的感染情况。

TiLV可以在鱼成纤维细胞（E-11）、罗非鱼脑细胞原代细胞、OmB和TmB等细胞系进行培养，其中E-11细胞被认为是最合适的细胞系[10]。其他细胞系，如CHSE-214、BF-2、BB、EPC、KF-1、RTG-2和FHM等，都不适用于培养TiLV[2]。用TiLV接种E-11细胞，5～10 d后出现明显的细胞病变效应（CPE），细胞质空泡化，形成空斑，9～10 d后出现单层细胞脱离[2，10]。TiLV接种罗非鱼原代脑细胞细胞系，接种后10～12 d细胞肿胀、变圆，出现颗粒细胞，接种14～19 d后单层细胞脱离[2]。OmB和TmB细胞对TiLV的敏感性与E-11细胞株相似。2份罗非鱼脑组织样品的细胞培养结果TiLV为阳性[10]。

原位杂交方法可以定位TiLV感染的靶器官。Bacharach等[5]通过原位杂交实验确定TiLV的靶器官，结果发现在脑和肝组织都出现病毒感染。片段1基因组RNA和mRNA的杂交信号被定位于脑组织的软脑膜，大部分靠近血管。片段5基因组RNA和mRNA也得到类似的结果。而未感染的健康对照组的脑组织切片未检测到杂交信号。肝脏的肝细胞中检测到片段3的mRNA的杂交信号。不同地理株感染的靶器官似乎有一定差异，泰国罗非鱼的肝、肾和鳃组织具有最强的原位杂交阳性信号[7]，而厄瓜多尔的TiLV主要分布在肝脏和胃肠道[4]。

由于TiLV基因组存在显著的地理差异，因而针对不同的地理株应用分子生物学方法，可能存在特异性和敏感性的不同，甚至出现假阴性的结果，需要不断进行改进。Surachetpong等[6]研究了泰国32起罗非鱼不明原因死亡病例的病原，应用PCR方法测试了325份样本，结果发现有22个发病点的鱼类样品呈TiLV阳性。Tsofack等[10]报告了更为灵敏的巢式RT-PCR方法，对厄瓜多尔、哥伦比亚和以色列毒株都可以进行有效扩增，适用于临床诊断。因该巢式PCR方法的外引物2的序列与鱼类基因相似，很可能导致非特异性扩增。Dong等[7]开发了一种半巢式PCR方法，可以避免引物2的影响。该方法是目前较理想的TiLV检测方法。

4 小结

TiLV已经对世界范围内的罗非鱼养殖带来巨大威胁。2017年5月，OIE、联合国粮农组织（FAO）、亚太地区水产养殖中心网（NACA）和国际农业研究磋商组织（CGIAR）等国际组织都针对TiLV发布了公告或预警[13-16]，要求所有成员加强对该病毒的检疫和防范。至今有关TiLV的生物学和流行病学特性还有许多未解之谜，包括TiLV是否可以感染罗非鱼以外的鱼类，其他鱼类或食鱼的鸟类等动物是否携带病毒，各种微生物和浮游生物是否被动携带病原，病毒能否在冰冻状态下存活并传染，新鲜的罗非鱼是否有活病毒等。

目前尚无有效控制TiLV的方法。限制病鱼的移动可在一定程度上控制疾病的传播。TiLV感染早期发育阶段的罗非鱼，因幼体阶段鱼类免疫系统还没有发育完全，因此疫苗对幼体的保护作用有限。防控措施包括减少污染物通过设备、车辆或人员进行传播，培育具有抗病性或对该病毒不敏感的养殖品系，开发无TiLV感染的SPF鱼苗，消除已被TiLV感染的罗非鱼亲鱼体内的病毒，研制有效的TiLV防控疫苗等。

我国罗非鱼苗种大多来自国外，目前口岸检疫部门尚未针对TiLV进行有效的检疫，因此存在TiLV通过国际贸易贸易传入的巨大风险。由于缺乏有效的病原诊断技术，我国对养殖罗非鱼的很多疾病无法进行深入研究。为有效控制TiLV在我国的传播，国内有关部门需要迅速开展全面系统的风险评估。在罗非鱼养殖区开展流行病学调查，并实施TiLV监控计划。口岸动物检疫部门更需要尽快建立快速、实用的检测方法，对进境的罗非鱼及其产品进行有效的检疫。

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（责任编辑：杜宪）

Research Progress on the Infection of Tilapia Lake Virus

Chen Xinzhong，Guo Shulin，Pang Lin，Gong Yanqing，Wang Lisheng，Luo Rui
（Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen，Fujian 361026）

S941.41

A

1005-944X（2017）10-0055-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.017

福建省引导性项目（2015N0015）