庄金秋，梅建国，王玉茂，姚春阳，莫 玲，沈志强

（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

水貂阿留申病毒实验室检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，王玉茂，姚春阳，莫 玲，沈志强

（山东省滨州畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

水貂阿留申病是一种在世界范围内广泛流行的、严重危害水貂养殖业的病毒性免疫抑制性传染病。本文介绍了水貂阿留申病毒的分离与鉴定、血清学和分子生物学最新实验室检测方法研究进展，以期为防控本病提供参考。

水貂阿留申病；检测；研究进展

Abstract：Aleutian disease of mink（AD）is a viral and immunosuppressive infectious disease，which is widely popular around the world and could cause serious harm to mink breeding industry. The latest research progress on laboratory detection methods of Aleutian mink disease virus was analyzed in this paper，including isolation and identification，serological and molecular biology，in order to provide reference for the prevention and control of the disease.

Key words：Aleutian disease of mink；detection；research advance

水貂阿留申病（AD）是由细小病毒科、阿留申病毒属的水貂阿留申病毒（ADV）引起水貂的一种慢性、进行性、免疫抑制性传染病，少数呈急性经过，多数呈慢性或隐性感染，不表现明显的临床症状。该病一方面引起成年貂繁殖能力减弱、皮张质量和健康状况下降以及死亡率增加；另一方面常造成新生幼貂的急性间质性肺炎甚至死亡[1]。AD是危害世界养貂业的三大疫病之一，给我国水貂养殖业造成了巨大的经济损失，严重危害我国毛皮产业的健康发展。截至目前，该病尚无有效的疫苗进行预防，也无特效治疗方法，主要防治方法是检测和淘汰阳性貂，逐步净化貂群。本文综述了水貂阿留申病毒最新实验室检测方法研究进展，以期为防控本病提供参考。

1 病毒分离与鉴定

采集患病水貂脾脏、淋巴结、肾脏等实质器官进行研磨、除菌处理后，接种猫肾传代细胞（CRFK）。在33 ℃、5% CO2培养箱内静置培养5～7 d，每天观察细胞病变，如出现细胞变圆、脱落、变成网状等病变时，需对分离病毒负染后进行电镜观察鉴定。电镜下ADV病毒粒子呈球形，直径22～25 nm，正二十面体对称结构。如果细胞没有出现病变，盲传5代后对细胞分离液进行PCR鉴定。常国权等[2]用直接电镜（DTEM）、胶体金免疫电镜（IEM-G）建立了对ADV的快速检测方法，发现胶体金免疫电镜的检测效果优于直接电镜，能对病毒在细胞中进行定位。病原分离鉴定是最直观、最准确的观测病原的方法，但由于耗时久、成本高、实验操作复杂且对人员和设备要求都较高，所以一般只用于实验室研究，不适合临床检测及大规模流行病学调查。

2 血清学检测方法

2.1 碘凝集试验（IAT）

IAT是最简单，也是最早被用于检测ADV的非特异性检测方法。Henson等[3]将该方法首次用于检测AD。IAT操作简单，方便观察，适用于养殖场基层的大群检测，此方法至今仍被我国的许多貂场及科研院所的实验室所使用。但该法只能在水貂感染该病的3周后才能检测到。另外所有能引起血清γ-球蛋白增高的疾病，如结核病、肝病、肾病、肺病等，均会出现IAT的阳性反应。该法的检测会有假阴性、假阳性的出现，因此只能作为检测该病的一种辅助方法。

2.2 对流免疫电泳（CIEP）

对流免疫电泳（CIEP）是国际上公认的ADV检测的“金标准”。该方法操作简单，在水貂感染ADV 7～9 d即可检出AD抗体的存在，这一点明显优于IAT。同时，该方法特异性高达97%，极少出现假阳性结果。Cho等[4]首次报道了通过CIEP法成功根除ADV，他们用了4年时间，利用该法在加拿大的3个水貂农场成功根除了ADV。随后该法很快在美国、加拿大、丹麦和前苏联等国被广泛采用。我国于20世纪80年代初开始应用并逐渐全面掌握此技术，在黑龙江、吉林、辽宁、山东等地对AD进行净化。CIEP法最初使用的抗原多是细胞抗原或脏器抗原，这有可能增加在环境中散毒的危险。应用重组ADV结构蛋白进行CIEP检测，可避免散毒并污染健康水貂群的危险。Clemens等[5]用重组牛痘病毒对ADV蛋白进行表达，Christensen等[6]用腺病毒进行表达，Knuuttila等[7]利用昆虫杆状病毒系统在SF9细胞中表达ADV野毒株的VP2蛋白获得抗原，均取得了成功。近年来，我国学者也开展了对重组表达蛋白的研究，曾祥伟等[8]用大肠杆菌作为表达系统对ADV的VP2片段进行了成功表达；张蕾等[9]将ADV VP2基因在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达。虽然CIEP法操作简便，且具有特异性强、敏感性高等特点，但当貂群中阳性率在5%以下时，应用本法检测发现每年阳性率不仅下降缓慢，有时还会发生反弹现象，很难彻底消灭本病。邵西群等[10]认为CIEP检测血液中的病毒抗体主要用于区分貂的病毒感染与未感染状态，不能鉴别是否为AD病貂，因此用单纯的CIEP检测方法淘汰阳性貂对貂群的抗病性不利，不适用我国ADV高感染率的防制。

2.3 火箭电泳

火箭电泳又称电泳免疫扩散、抗原-抗体电泳或单向定量电泳。这种定量免疫电泳是对 CIEP（定性免疫电泳）的重要突破，可用于精确计算免疫球蛋白的含量。但由于这一新技术需要精密仪器、操作复杂、检测成本高，不适用于实际应用。

2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）

Wright等[11]首次建立了ADVELISA检测方法。但因当时的假阴性率很高，限制了该法的应用。Knuuttila等[7]通过昆虫杆状病毒表达系统表达的重组VP2蛋白病毒样颗粒（VLPs）作为包被抗原建立了检测ADV血清抗体的间接ELISA，以HRP标记的山羊抗猫抗体作为二抗，检测316份水貂血清，并与传统的、以含有VP1和VP2的全病毒粒子作抗原的CIEP进行比较，发现二者具有较好的一致性。Andersson等[12]将此VP2-ELISA和以ADV-G细胞纯化抗原为检测抗原的间接ELISA试剂盒（ADV-G-ELISA）与传统的CIEP进行了比较研究，均以CIEP为金标准，检测364份水貂血清，发现VP2-ELISA的敏感性和特异性分别为99.7%和98.3%；检测359份水貂血清，ADV-GELISA的敏感性仅为54.3%，特异性为93.2%。目前该VP2-ELISA已发展成为一种可自动化操作的商品化ELISA试剂盒在北欧地区得到广泛应用。Rebekka等[13]建立了以含有整个ADV-G病毒粒子的ELISA Danad抗原为包被抗原的全自动化ELISA法，并与CIEP法进行比较，发现其敏感性高但特异性低。该法的优势在于它的全自动化，每天可处理大批量的样本，不需要太多的人力操作。目前该ELISA法已被丹麦当局批准用于AD的诊断。

我国的学者在ELISA方法方面也进行了大量的研究。吴威等[14]建立了PPA-ELISA方法检测水貂血清中ADV抗体，证明该法快速准确，且敏感性高于CIEP法。但由于需要在细胞培养板中培养病毒等操作相对复杂，未被推广应用。徐磊等[15]用大肠杆菌系统表达的VP2重组蛋白作为包被抗原建立了ELISA，检测不同地区水貂血清，发现与CIEP的符合率达93%。王振军[16]也建立了ADV VP2蛋白的ELISA方法，检测血清样品420份，发现与CIEP的符合率为89.9%。李晶等[17]建立了VP2蛋白Dot-ELISA的方法，发现敏感性要高于CIEP，并且适用于基层单位对于ADV的快速检测。黄盼盼[18]将人工抗原SD蛋白和APTES共同包被建立了间接ELISA方法，发现与CIEP方法比较具有较高的符合率，为93.2%。贾赟[19]基于ADVVP2酵母表达重组蛋白建立了间接ELISA方法，检测285份血清样品，发现与CIEP的符合率为95.7%。韩铠怿[20]针对VP2基因的抗原位点进行大肠杆菌原核蛋白的表达，建立了间接ELISA方法，应用该法对84份血清进行检测，发现检出率为26.2%。陈小微[21]应用大肠杆菌原核表达并纯化出了ADV VP2332-452蛋白建立了ELISA方法，对2014年到2015年间自黑龙江和吉林采集的596份貂血清样品进行检测，发现阳性率为65.9%。杨柳枝[22]以ADV重组蛋白sd作为包被抗原研制出了sd-ELISA抗体检测试剂盒，对我国山东、大连、吉林、黑龙江、河南等主要养貂区域的2 190份血清进行检测，发现阳性率高达78%。王元智[23]利用VP2重组蛋白作为抗原制备鼠源单克隆抗体作为包被抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记多抗后作为检测抗体，从而建立了检测ADV的双抗体夹心ELISA方法。ELISA为临床上提供了一种更加敏感、快捷、特异、稳定的ADV检测方法，近年来该方法正在逐步取代CIEP方法。

2.5 免疫复合物法（CIC）

AD主要是由抗原抗体结合形成的免疫复合物引起的疾病，所以检测免疫复合物的含量也是检测 AD的一种方法。赵元楷等[24]建立了聚乙二醇沉淀比浊法，用于检测水貂血清中免疫复合物，并应用于实践。陈德宇等[25]采用兔抗水貂抗体包被ELISA反应板，建立了检测AD病貂血清中特异性IgD及IgE型循环抗原-抗体免疫复合物水平的捕获ELISA法。

2.6 间接免疫荧光试验（IFA）

Porter等[26]首次利用IFA来检测AD，人工感染9 d后从血清中检出抗ADV抗体。该法特异性强，但需要进行细胞培养，周期较长，且重复性差，所以不适合应用于临床诊断。

2.7 补体结合试验（CF）

Mcguire等[27]首次应用CF法检测AD，在人工感染水貂3周后，可在被感染貂的血清中检测出补体结合抗体。该方法敏感性较高，但操作繁琐，一直未应用于生产实践。

2.8 胶体金免疫层析技术（GICA）

GICA是免疫层析技术、胶体金标记技术及免疫反应的结合体。该技术具有简便快速、结果清晰，可通过肉眼观察、灵敏度高、无污染和携带方便等优点，在兽医学领域应用越来越多。徐磊[28]利用原核表达系统表达ADV结构蛋白VP2的部分基因片段建立了GICA方法，临床应用效果较好。

3 分子生物学检测方法

3.1 PCR

PCR不仅可检测外周血，还可对CIEP无法检测的样品进行检测，如木乃伊胎、死胎或其他组织标本等。Jensen等[29]根据ADV NS1基因序列设计引物建立PCR，并比较了PCR和CIEP 方法检测ADV的差异。在55个已知感染ADV和8个未感染ADV的农场，共采集299份水貂脾脏和淋巴结及血清样品，结果发现PCR敏感性为94.7%，特异性为97.9%，PCR与CIEP具有较高的一致性。邵西群等[10]用PCR方法检测ADV，发现来自不同时期的血样、不同组织的样品的检测结果不一致，体现了动物感染过程中病毒的不稳定性。许秋等[30]根据ADV的NS1基因设计引物建立了PCR方法，发现最低能检测到的病毒核酸量为2.53 ng/mL，临床样品检测表明PCR检出率为90%，CIEP检出率为83%。杨瑞梅等[31]首次应用纳米PCR技术对ADV NS1基因进行检测，发现敏感性比CIEP大大提高，从而为用粪、尿等低病毒样品ADV检测提供了一种新的有效方法。

3.2 荧光定量PCR

荧光定量PCR为ADV的快速检测及净群根除提供了有效的技术手段。张瑞[32]建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法，发现灵敏度可达7.8 拷贝/反应，具有很好的特异性和重复性。张秀丽等[33]也建立了检测ADV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，利用该法对8份疑似ADV病料进行检测，发现阳性率为75%。贾赟[19]成功建立了一种用于检测ADV的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法，应用该法检测了40份临床样品，发现阳性率为52.5%（21/40），较普通PCR的45%（18/40）提高了7.5%的检出率。

3.3 PCR-DHPLC

变性高效液相色谱分析（DHPLC）是近年来建立并迅速发展的一种新型基因突变筛查技术。贾赟[19]根据ADV VP2基因序列设计引物，经过对DHPLC各种反应条件的优化，成功建立了PCR-DHPLC方法，发现最低检测限为10 拷贝/反应。应用该法检测126份临床样品，检出率为48.4%，和荧光定量PCR的检测限相当，比PCR电泳法高10倍。该方法为ADV的检测提供了新型、简便、高通量的检测技术储备。

3.4 核酸杂交技术

该方法最大优点是适用于数量较多的群体筛选。Haas等[34]用该方法对水貂种群感染ADV后的脾、肾、骨髓和淋巴结等器官中提取的DNA样品进行检测，只在脾和骨髓内检测到病毒DNA。

3.5 基因芯片技术

朱善元等[35]根据ADV序列，针对VP2蛋白设计引物，在探针反相杂交技术的基础上，结合核酸分子碱基互补配对原则、基因芯片和酶联显色技术的基本原理制备成基因检测芯片检测 ADV。该方法比Dot-ELISA试剂盒高出17%，能克服PCR方法中DNA污染的缺点。基因芯片检测方法的特点是可以在患病早期、准确大批量的检测ADV，这对于预防和控制疫情的蔓延十分重要。

3.6 环介导等温扩增技术（LAMP）

LAMP技术是一种恒温扩增技术，具有高效率、高特异性及快速反应的特点。张卓[36]、田国宁等[37]根据ADV VP2基因设计引物建立了LAMP方法，发现检测灵敏度是普通PCR方法的10倍。贾赟[19]也根据ADV VP2基因设计引物建立了LAMP方法，应用该法对126份水貂样品检测时，发现LAMP、荧光定量PCR阳性检出率为48.4%（61/126），高于普通PCR的44.4%（61/126）。LAMP简便快速，既能满足对ADV实验室检测，又适合于基层的快速筛查，为AD的临床诊断与流行病学调查提供了新的技术手段。

4 小结

近年来，由于我国水貂养殖规模扩大、养殖密度提高、养殖方式落后及对AD的防范力度不够等原因，导致AD在我国水貂养殖地区广泛流行且有扩大的趋势。水貂感染ADV后，体内不产生或只产生少量的中和抗体，而产生的大多抗体，不仅不能中和病毒，反而会介导抗体依赖性增强作用，从而促进ADV侵染靶细胞，最终导致宿主全身免疫功能紊乱及接种疫苗免疫失败。由于ADV尚无有效的疫苗控制，所以对貂群进行净群、消除带毒水貂就成了控制该病的有效方法，采用快速、高效、灵敏的检测方法对控制疾病具有重要意义。近年来，研究者建立的不同检测方法各有利弊，在应用中要结合实际情况选择适合的一种或多种检测方法进行疾病监测、诊断，从而最终达到淘汰阳性水貂、逐步净化种群、建立无疫病养殖场的目的。

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（责任编辑：杜宪）

Research Progress on the Detection Methods of Aleutian Disease of Mink

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Wang Yumao，Yao Chunyang，Mo Ling，Shen Zhiqiang
（Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600）

852.65

A

1005-944X（2017）10-0050-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.016

山东省现代农业产业技术体系特种经济动物创新团队项目（SDAIT-21-15）