向 蓉，黄 勉，向 华，王晓虎

（1. 广东省农业科学院动物卫生研究所，广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东广州 510640；2.广州动物园，广东广州 510070）

小反刍兽疫流行状态及检测方法研究进展

向 蓉1，黄 勉2，向 华1，王晓虎1

（1. 广东省农业科学院动物卫生研究所，广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东广州 510640；2.广州动物园，广东广州 510070）

小反刍兽疫（PPR）是由小反刍兽疫病毒（PPRV）引起小反刍动物的一种急性接触性传染病。近年来，我国西藏、辽宁等地陆续暴发该病，给当地养羊业带来了严重经济损失。本文介绍了PPR的流行现状、传播途径、易感动物，阐述了PPRV的实验室检测方法，包括常规诊断、核酸检测方法（cDNA探针杂交、RT-PCR方法、实时荧光定量PCR 技术、反转录环介导等温扩增技术）、血清学诊断（竞争 ELISA、间接ELISA、夹心ELISA 方法）等，以期对该病的防控提供借鉴。

小反刍兽疫；流行现状；检测方法

Abstract：Peste des petits ruminants（PPR）is an acute contagious infectious disease，caused by Des Petits Ruminants Virus（PPRV）. In recent years，PPR outbreaks occured in Tibet，Liaoning and other provinces of China and caused severe economic losses. The epidemic status，route of transmission and susceptible animals of PPR were introduced in this paper. The laboratory detection methods，including routine diagnosis，nucleic acid detection method（cDNA probe hybridization，RT-PCR，RT-qPCR，RT-LAMP）and serological diagnosis method（cELISA，iELISA and sELISA）were analyzed，in order to provide reference for the disease prevention and control .

Key words：Peste des petits ruminants（PPR）；epidemic status；detection methods

小反刍兽疫（PPR）是由副粘病毒科、麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒（PPRV）感染引起的一种烈性、接触性传染病，以山羊和绵羊最为易感。临床上以高热、坏死性胃炎、胃肠炎和肺炎为主要特征，发病率和病死率分别高达100%和90%，对反刍动物危害极大[1-2]。近年来，PPR的发生呈上升趋势，在多个国家和地区不断蔓延。2007年，我国西藏地区首次发生PPR疫情之后，许多地方陆续有发现该病的报道。了解该病的国内外流行状态，掌握PPRV快速检测技术，对该病的防治工作意义重大。

1 PPR的流行状态

1.1疫情史

1942年PPR首次发现于西非的科特迪瓦[3]，距今已有73年的历史。1983年该病首次出现于阿拉伯半岛，1987年又传入印度。2007年7月，我国西藏地区的革吉县、日土县、札达县相继发生了牛PPR疫情。这是我国首次报道发生PPR疫情。其后该病陆续出现在我国辽宁、黑龙江、江苏、四川等地[4]。至今，我国新疆和西藏地区至少暴发5起PPR疫情。

1.2空间分布

2014年，我国陆续有7个省市出现PPR疫情，总体趋势是自西部地区向东部地区流行[5]。近年来，PPR逐渐跨越地理屏障，扩散趋势不断持续。我国周边国家，如印度、阿富汗、尼泊尔、塔吉克斯坦等地也都有PPR流行的报道[6]。目前，该病已经扩散到亚洲、非洲地区的40余个国家。撒哈拉以南的非洲地区、阿拉伯半岛、中东和南亚都是该病的主要流行地区，而且流行形势日趋愈严峻[7]。

1.3种间分布

PPRV主要感染绵羊和山羊，但山羊比绵羊更为易感，且症状也更加严重。不同品种、不同年龄的羊对PPRV的敏感性有显著差别。例如，欧洲品系的羊易感性较高，幼龄羊比成年羊更为易感，但在哺乳期的幼仔具有较强的抵抗力。有报道称，猪也可能感染PPRV，但表现为隐性感染，并不表现临床症状，也不会成为传染源而向外界排毒[3，8]。牛也有发生该病的可能。目前，尚无人感染PPRV的报道[9-10]。该病的野生动物流行病学调查结果显示，野生小反刍动物也对PPRV敏感。我国西藏地区曾发生2起野生小反刍动物感染PPR而死亡的疫情。此外，野生动物的活动可能会加大PPRV的扩散速度和范围。有关野生小反刍动物和PPR感染的关系仍需进一步深入的研究[11-12]。

1.4传播途径

PPRV具有高度接触性，主要通过呼吸系统传播。精液和胚胎也是造成动物感染的途径之一[13]。此外，近距离的动物间也可以通过气溶胶形式传播。健康动物与被病羊污染的饮水、饲料、工具、水槽、圈舍接触，也有可能被间接感染。但由于PPRV对外界的抵抗力很弱，病毒在外界存活时间较短，因此间接传播不是主要的感染方式。有研究报道，处于潜伏期和恢复期的山羊也具有传染性[14]。

2 PPRV的实验室检测

实验室检测是PPR诊断和有效防控的依据。近年来，PPRV诊断技术得到很大发展，各种血清学及核酸诊断技术对于PPRV的防控效果显著。

2.1常规诊断

PPR的常规诊断技术主要有病毒分离鉴定、琼脂免疫扩散试验（AGID）和胶体金试纸条等。

PPRV 可在非洲绿猴肾细胞（Vero 细胞）、胎绵羊肾细胞、胎羊及新生羊睾丸细胞上增殖产生细胞病变（CPE）并形成合胞体。AGID是一种简单廉价的检测方法，但其敏感性相对较低，因此基本不会用于标准诊断[15]。何红菊[16]利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，利用PPRV小鼠单抗和山羊多抗制备出检测PPRV抗原的胶体金层析试纸条，之后又对试纸条制备程序进行了优化，成功建立了一种特异、快速检测PPRV抗原胶体金免疫层析试纸条。

2.2核酸检测方法

2.2.1cDNA探针杂交。随着对PPRV 基因组序列的掌握，利用cDNA探针来对核酸进行标记的核酸杂交方法得到建立。cDNA 探针用32P或地高辛等标记，以检测可与其互补形成双链复合体的PPRV 基因序列。Diallo等[17]于1995年就将探针杂交广泛应用到PPRV抗原的检测。

2.2.2RT-PCR方法。Hymann等建立了检测PPRV的两步法RT-PCR。Balamurugan等[18]又于2006年改进建立了一步法RT-PCR，其操作过程简单且不易污染。姚李四等[19]针对PPRV先用普通RT-PCR进行筛选，再用巢式RT-PCR进行排除和鉴定，可以提高特异性。2010年，毛立等[20]建立了一种可特异扩增PPRV N蛋白异变基因，而不能扩增RPV和CDV N基因的检测方法。张玲等[21]针对H基因或全基因序列，建立的区分PPR疫苗毒与基因Ⅳ系野毒的RT-PCR 检测方法，能特异性区分疫苗株Nigeria 75/1与基因Ⅳ系PPRV，与基因Ⅲ系、牛瘟病毒、犬瘟热病毒等同属病毒无交叉反应；最低检测浓度为7.7×10-5ng/μL RNA模板。该方法操作简单、耗时短，可初步用于临床鉴别诊断。

2.2.3实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR 技术凭借其特异性更强、有效解决PCR 污染问题、自动化程度高等诸多优点开始应用于PPRV 的检测，并取得了不错的成果。吴绍强等[22]以N基因序列为靶基因，通过设计引物及TaqMan探针建立了快速检测PPRV的荧光PCR方法可区分PPRV及RPV感染。所建立的方法检测线性范围为1～1×106拷贝质粒DNA，灵敏度可达10拷贝质粒DNA，是常规PCR法的100倍。袁向芬等[23]对GenBank已公布的PPRV N基因序列进行分析，设计特异性引物与探针，建立了PPRV通用型与Ⅱ系疫苗毒特异型二重实时荧光 RT-PCR 方法，同时建立了针对PPRV Ⅳ系强毒株的特异型荧光PCR方法。

2.2.4反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）。李伟等[24]针对PPRV-N 基因保守区域设计4条引物，采用一步法RT-LAMP建立了一种检测PPRV的方法。该方法从核酸抽提到检测结果出现仅需70 min，具有良好的特异性，与同属的犬瘟热病毒无交叉反应，灵敏度是RT-PCR的1 000 倍，是巢式RT-PCR的100倍。李林等[25]建立的PPRV LAMP检测体系亦具有较高的特异性和检测灵敏度，比普通RT-PCR灵敏性高10倍，与荧光定量RT-PCR的灵敏度相当。

2.3血清学诊断。常规血清学试验包括病毒中和试验（VNT）、对流免疫电泳试验（CIEP）、间接荧光抗体试验（IFAT）和 ELISA 等。其中，ELISA方法相比上述几种方法更方便、快捷，适用于大量样品的检测诊断[13，18]。

2.3.1竞争 ELISA（c-ELISA）。世界动物卫生组织（OIE）推荐的用于检测PPRV抗体的方法是一种用抗PPRV H蛋白的单克隆抗体作为特异性竞争单抗建立的c-ELISA。Kang-Seuk等利用重组N 蛋白及其单抗建立了一种快速cELISA（rapid-cELISA）。该方法通过对单抗进行定量来检测和监控PPR，敏感性和特异性分别达93.4%和98.5%，且可鉴别PPRV和RPV。邱文英等[26]以1D5作为竞争抗体、纯化后的rpET-PPRN 蛋白作为包被抗原，建立了检测PPR血清抗体的单抗c-ELISA方法。该方法能够特异性区分牛瘟阳性血清和PPR阳性血清。应用该检测方法检测129 份山羊（Capra hircus）血清样品，与标准c-ELISA试剂盒的符合率为96.9%。

2.3.2间接ELISA（i-ELISA）。李伟等[27]建立了基于Bac-to-Bac杆状病毒-昆虫表达系统表达的PPRV N蛋白的i-ELISA方法。利用该方法检测来自西藏疫区的37份山羊血清和青海省非疫区92份山羊血清，与法国蒙彼利埃农学发展研究国际合作中心（CIRADEMVT）提供的竞争ELISA试剂盒相比，特异性为96.2%，敏感性为100%，二者的符合率达到96.9%，表明建立的i-ELISA方法可以很好地用于PPR的临床诊断。曾少灵等[28]预测N蛋白的B细胞抗原表位，设计4段多肽并人工合成，作为包被抗原建立的PPR血清抗体间接ELISA检测方法，用于检测PPR的山羊临床血清样品，以对预测的B细胞抗原表位进行验证。结果显示，建立的间接ELISA敏感性为96.0%，特异性为96.25%，与进口标准竞争ELISA试剂盒的符合率为96.15%。

2.3.3夹心ELISA 方法（sELISA）。Singh等针对PPRV N 蛋白抗原表位单抗4G6建立了夹心ELISA方法。首先使用多抗血清捕获抗原，然后用单抗进行特异性检测，其特异性可达92.8%，敏感性可达88.9%，能够有效避免前带效应，适用于野外样品的检测。

3 小结

长期以来，很多国家和地区忽略了对PPR的深入研究。其在世界各地的暴发和流行，以及近期PPR疫情在我国部分省份的发生和流行，提示必须加强对PPRV 的研究，尤其要加强PPRV分子生物学方面的研究，尽快建立可快速有效鉴别PPRV、RPV、疫苗毒株与强毒株的快速诊断方法以及安全有效的药物、疫苗，以达到防控并最终消灭、净化PPR。

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（责任编辑：杜宪）

Research Progress in Epidemiology and Diagnostic Technologies of Peste Des Petits Ruminants

Xiang Rong1，Huang Mian2，Xiang Hua1，Wang Xiaohu1
（1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Livestock Disease Prevention，Institute of Animal Health，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou，Guangdong 510640；2. Guangzhou Zoo，Guangzhou，Guangdong 510070）

S858.26

A

1005-944X（2017）10-0046-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.015

广东省省级科技计划项目（2015A020224018，2015A010107009），广东省农业科学院“十三五”学科团队建设项目

王晓虎