韩立强，王月影，王林枫，朱河水，钟 凯，褚贝贝，杨国宇

（河南农业大学牧医工程学院/农业部动物生化与营养重点实验室，郑州 450002）

奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮细胞的表达定位及对SCD1基因启动子的转录调控

韩立强，王月影，王林枫，朱河水，钟 凯，褚贝贝，杨国宇

（河南农业大学牧医工程学院/农业部动物生化与营养重点实验室，郑州 450002）

【目的】固醇调节元件结合蛋白 1( SREBP1)作为核转录因子，对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用，为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的cDNA为模板，采用分段克隆的方法获得SREBP1基因的编码序列，通过重组酶与pcDNA3.1载体进行重组环化构建pcDNA3.1-SREBP1表达载体，将构建的载体测序验证后提取质粒，转染奶牛乳腺上皮细胞。以EIF3K基因为内参基因，采用荧光定量PCR检测SREBP1基因mRNA的表达差异；采用免疫荧光的方法对SREBP1进行标记，以DAPI复染细胞核，激光共聚焦观察SREBP1蛋白的亚细胞定位；转染含有不同调控元件的SCD基因启动子，同时转染1.0 µg pcDNA3.1-SREBP1作为处理，荧光素酶报告基因系统分析启动子活性；分别转染0.25、0.5和1µg的pcDNA3.1-SREBP1载体，分析pGL3-SCD 2 和pGL3-SCD3启动子活性与SREBP1之间的量效关系。【结果】分段克隆得到的PCR产物分别为1 170、1 116、363和900 bp的片段，经过与pcDNA3.1载体重组后获得pcDNA3.1-SREBP1表达载体，经酶切和测序验证，发现除1个无义突变外，与标准序列完全相同，整个序列长度达到3 510bp；将pcDNA3.1-SREBP1载体转染乳腺上皮细胞后，Real-time PCR检测发现与转染空载体的对照组相比，SREBP1基因的mRNA表达倍数增强130.4倍（P＜0.001）；……