王晛珏，苏秀兰

生物活性肽制备、纯化和分析的研究进展

王晛珏，苏秀兰

生物活性肽具有特殊的生理特性，其在医药和保健食品领域的研究已成为热点。现代科学发展不仅要求能够分离得到具有不同功能的活性肽类，更重要的是能够经过进一步纯化和鉴定得到准确的肽结构、氨基酸序列以及功能通路。

生物活性肽分子质量小但活性显著，主要根据不同的氨基酸的排列顺序而表现出抗氧化、清除自由基、免疫调节、抗癌、抑制病毒等特性[1]。生物体内的活性肽是蛋白质长链经过一定程度的水解之后，将非活性的短肽释放出来，形成的有特殊功能的活性物质[2]。但是，从天然物质中提取活性肽却十分困难，通常每毫克组织中能够有效提取的肽含量很低，又受到原材料来源和分离方法的限制，因此，迫切地需要有效的分离提取、纯化和鉴定的技术来发现和获得更多的生物活性肽。

生物活性肽的制备方法通常有：酶法、微生物发酵法、生物合成法以及基因重组法等。提取纯化的方法有：膜分离技术、层析技术、电泳技术、色谱技术以及探针分离法等；同时还会将多种方法进行联用，以期获得更加单一和结构清晰的活性肽，例如高效液相色谱与质谱联用。利用不同的分离技术获得的生物活性肽均显示出较好的生物学作用。通过小鼠负重游泳试验证明，利用木瓜蛋白酶酶解林蛙油制备的生物活性肽能够有效缓解疲劳[3]。凌敏等[4]研究发现，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌均是碱性蛋白酶的生产菌，但地衣芽孢杆菌比枯草芽孢杆菌具有更强的分泌碱性蛋白酶的能力。通过重组 DNA 实现嗜碱性芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶在地衣芽孢杆菌中的分泌表达，能够提高表达量，并缩短发酵周期。色谱和质谱联用可同时实现单一组分的分离和氨基酸序列的鉴定，在现实中得到广泛应用。Puchalska 等[5]采用高效液相-电喷雾四极杆飞行时间串联质谱技术（HPLC-ESI-Q-TOF）提取到亮氨酰-丝氨酰-脯氨酸、亮氨酰-谷氨酰胺酰-脯氨酸和亮氨酰-精氨酰-脯氨酸 3 种玉米抗压肽。Zhao 等[6]利用超滤和连续色谱分离纯化鹿茸得到4 种具有抗炎作用的活性肽，并用液相色谱串联质谱进行肽结构的鉴定。

随着技术的进步，科研水平的完善以及人类需求的扩大，生物活性肽的制备、纯化和鉴定的方法已不局限于一种或几种方法，而是将多种高效的手段串联起来发挥更全面的作用。但是无论使用何种方法制备得到的肽产物其实是包含杂质的混合物，在进行必要的分离纯化后，得到的产物依然存在糖类、盐类及水分等物质。肽的制备和应用受到多种因素的制约，为得到其中有效组分，各种方法也在不断更新和进步，笔者从健康和高效的角度出发，筛选出制备、纯化和分析生物活性肽的有效方法供大家参考。

1 发酵法制备生物活性肽

制备生物活性肽的方法主要有酶解法、发酵法和定向合成法等几种。酶解法条件温和、快捷、安全、过程易控制。蛋白质经过预处理可提高酶对蛋白质的敏感性，酶解技术可控制酶切位点，保证产物一定的分子质量。其局限性在于必须选择合适的酶和确定所需的时间、温度、pH 等条件[7]。定向合成法包括：液相法、固相法、酶法合成及 DNA 重组等，其中液相法适合小肽合成；DNA 重组使活性肽的产量和纯度提高。但液相法不适合用于反应中间体溶解度低的情况；固相合成限于 40～200 个氨基酸[8]。而发酵法制备活性肽的优势在于生产的活性肽多来源于食品，更安全，可同时利用微生物降低或消除苦味。制备的关键是发酵菌株的选择。

1.1 发酵法的应用原理

微生物发酵工艺根据底物的不同分为液态发酵和固态发酵两种，其基本原理是利用菌种在其代谢过程中产生的蛋白酶，将活性肽片段从底物蛋白中水解出来，实现对发酵产品的分离纯化[9]。

固态发酵是先选择合适的菌种进行扩大培养后得到产量大、活性好、抗杂菌能力强的发酵基团。将经过灭菌和调制的预处理原料与发酵基团混合，进入发酵生产过程。固态发酵是需氧发酵，物料厚度要适当和均匀，保证通风透气；而且发酵的过程中会产生热量，需要经常翻动来蒸发水分。固态发酵的不足之处在于发酵过程需要接触外界空气，容易受到杂菌的污染。因此需根据不同菌种的特性，提供足够的营养和条件，使菌母形成绝对的生长优势，从而抑制杂菌。曹亚兰[10]分别利用固态发酵和酶解偶联制备大豆抗氧化活性肽，结果证明发酵法制备的大豆肽比酶解法制备的肽具有更高的抗氧化能力。许芳等[11]利用混合菌类固态发酵水解脱脂大豆粉制备活性肽，水解度可达到 90.61%。

液态发酵分为单菌发酵和复合菌种发酵两种。单菌发酵是细菌或真菌液态发酵，复合菌发酵是真菌和细菌的混合发酵。混合菌种发酵具有细菌和真菌的双重优点，产生的蛋白酶酶活强，而且酶系丰富，使发酵更迅速、更彻底。因此，复合菌液态发酵制备生物活性肽非常有研究价值。与固态发酵相比，液态发酵有发酵周期短，生产效率高，菌种生长状况好等优点，适合大规模工业化生产[12]。盖梦和张美莉[13]用液态发酵法制备燕麦 ACE 抑制肽，在发酵时间 39 h，初始 pH 9，发酵温度 34 ℃ 的条件下验证 ACE 抑制率为63.96%。李爱晨[14]在 32 ℃，pH 7，料液比为 4% 的条件下液态发酵黑曲霉和米曲霉混合菌种 48 h 制备米糠肽，肽转化率达到 59.86%。相对于固态发酵法，液态发酵法便于实时观测实验现象和进度，更有利于控制米糠肽的转化率。Torino 等[15]比较了固态和液态发酵小扁豆获得的水溶性提取物的生物活性，结果显示，液态发酵的水溶性提取物含较多总酚和抗氧化物，在抗高血压的治疗上有广阔前景。

1.2 发酵法的优势

相对于酶解法，微生物发酵的过程中能够产生多种蛋白酶，有效避免了单一酶类水解不完全的问题；同时，快速繁殖和高产的菌类替代了酶解中的纯化过程，有效降低了生产成本。在生产过程中无需附加条件，不会给产品带来过多的无机盐成分，同时植物原料的发酵副产品可用作饲料，有效避免浪费。微生物发酵的另一个优势在于可以对某些苦味肽基团进行修饰和重组，获得的活性肽能达到基本无苦味，可以有效运用到保健食品领域[16]。在微生物发酵过程中添加酵母菌、乳酸菌或醋酸杆菌等有益菌，可产生有香味的有机酸，从而改善发酵产物的风味。

微生物发酵的原材料富含蛋白质，例如乳制品、大豆、米糠等，通过控制不同的发酵条件，以可食用的动植物蛋白做发酵原料，生产出多种安全可靠的生物活性肽类。正所谓“药食同源”，这些活性肽更有利于人体消化和吸收，具有广阔的应用前景。

1.3 发酵菌株的选择

微生物发酵常用的菌株有芽孢杆菌、酵母菌、米曲霉、黑曲霉、乳酸菌等。下文就几种发酵效率高的菌株进行详细论述。

1.3.1 芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌是碱性蛋白酶的主要生产菌，但地衣芽孢杆菌的分泌能力是枯草芽孢杆菌的 2 倍，且地衣芽孢杆菌生长缓慢，能够使分泌出的蛋白充分折叠和运输[17]。

有实验证明，通过重组地衣芽孢杆菌的 DNA 来实现碱性蛋白酶高分泌量，并缩短发酵周期而制备出高纯度的酪蛋白磷酸肽[4]。王文平[18]发酵豆粕制备大豆活性肽，证明枯草芽孢杆菌的蛋白水解能力要优于米曲霉、黑曲霉和酵母菌，且枯草芽孢杆菌的单菌水解度要高于混合菌。管国强等[19]以大豆肽转化率为指标，优化了枯草芽孢杆菌 ZC1 发酵豆粕制备大豆肽的工艺条件。在料液 pH 5.42、碳源含量1.73%、发酵时间 43.45 h 的条件下发酵羊胎盘下脚料制备的免疫活性肽对小鼠淋巴细胞的促增殖作用显著[20]。

1.3.2 米曲霉与黑曲霉 米曲霉是生产蛋白酶的优良菌种，米曲霉在生长过程中分泌的蛋白酶的活性高低受到其利用的物料以及生产环境的影响[21]。黑曲霉所产生的酸性蛋白酶是具有良好热稳定性和金属离子稳定性的端肽酶[11]。

比较枯草芽孢杆菌、黑曲霉和米曲霉发酵羊胎盘残留物制备的活性肽，证明黑曲霉的发酵产物多肽含量最高，且抗氧化性能最好，在相同胎盘肽质量浓度 100 μg/ml 下，黑曲霉的免疫细胞刺激指数达到 24.89%[22]。武金霞等[23]利用米曲霉发酵蝇蛆蛋白，获得质量浓度为 7.9 mg/ml、肽转化率为 31.6% 的蝇蛆肽，经 SDS-PAGE 检测其分子质量为4.3～65.9 kD。

1.3.3 乳酸菌 国外学者通常利用乳制品发酵制备生物活性肽。乳酸菌的蛋白水解系统主要有：将酪蛋白水解成寡肽的酶类；转运寡肽的特殊蛋白；以及进一步水解寡肽的胞内肽酶[24]。类似乳酸菌的研究还包括嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌等，它们高效的蛋白质水解系统均有利于活性肽的释放。张奕[25]利用10 种乳酸菌和 4 种酵母菌发酵驼乳制备免疫活性肽。在制备大米蛋白 ACE 抑制肽中，乳酸菌的脱蛋白能力要明显优于芽孢杆菌，且乳酸菌与胃蛋白酶、菠萝蛋白酶的组合脱除率最高达到 91%[26]。

1.3.4 复合菌 微生物通过自身生理活动产生多种功能的肽酶谱系，这些酶类将发酵产物中的基团修饰和重组，让肽段之间或与氨基酸之间进行重组，进而改善多肽的功能和特性。不同微生物内存在不同的蛋白酶系，产酶的种类与数量会随着生产条件的不同而发生改变。不同的菌种有不同的发酵效果，根据各菌种的生长条件和生理特性来选择最优的发酵条件，可以充分发挥其发酵优势。例如用于花生粕发酵时，枯草芽孢杆菌多用于液态发酵，而霉菌多用于固态发酵，近些年用混合菌种固态发酵花生粕制备生物多肽的案例有很多[27]。

张吉鹍[28]曾提出利用多菌种组合固态发酵法生产大豆肽蛋白饲料。有研究显示，以黑曲霉与枯草芽孢杆菌 1∶1.5的比例共生发酵甘薯蛋白 48 h，制备的活性肽产量高[29]。王玮[30]利用米曲霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌和啤酒酵母组合发酵花生粕制备抗氧化肽，证明米曲霉和酵母菌以 1.4∶1的比例发酵效果最佳。

复合菌种的发酵虽然具有很多优点，但是不同菌种之间存在相互拮抗作用，可以通过控制菌种的比例和添加量来降低这种作用。另外，高产菌种的筛选仍需要继续深入探索和研究。

2 亲水作用色谱分离提取生物活性肽

1990年，美国科学家 Alpert 首次提出了亲水作用色谱（HILIC）的概念[31]，但早在 20 世纪 50年代，亲水作用色谱就有使用的记录，直到 2000年前后该方法得到了广泛的应用。

2.1 亲水作用色谱的应用原理

亲水作用色谱是液相色谱中的一种，是亲水基质分离的有效手段，随着固定相和溶质的极性增加，而有机溶剂的极性减小来实现分离，与反向液相色谱的原理相反[32]。

亲水作用色谱利用强极性的固定相结合不同比例的有机相与水组成的流动相来实现对强极性化合物保留的目的。亲水性的固定相表面附着一层富水层，富水层与贫水的流动相形成一个液/液萃取的系统，溶质通过这个萃取系统实现保留。

亲水作用色谱的固定相是与水有较好亲和性的强极性基团。其中，氨基键合相是较早用于亲水作用色谱的固定相，对碳水化合物有良好的分离选择性[33]。硅胶是最早应用于亲水色谱的固定相，其具有良好的质谱兼容性[34]。酰胺键合相和聚（琥珀酰亚胺）型键合相具有很好的亲水性和独特的分离选择性，被广泛用于多肽的分离，在蛋白质组学中发挥重要的作用。两性离子键合相表面的正负官能团具有良好的亲水性，同样在蛋白质组学中有良好的应用[35]。

另外，亲水色谱的流动相是乙腈-水或挥发性缓冲盐溶液体系，水相的比例最高达到 60%，是为了能够保证固定相颗粒被充分地润湿并保持亲水作用[36]。流动相的种类和有机溶剂的含量都会对溶质的保留产生影响，在流动相中，必须有一定比例的有机溶剂方能体现出溶质与固定相的亲水作用。有时流动相中的有机溶剂与水分的组成已不能满足色谱的分离效果，有人考虑用盐来调节流动相的浓度，如甲酸铵、乙酸铵等[37]。

2.2 亲水作用色谱分离生物活性肽的优势与应用前景

亲水作用色谱不仅能够分离少于 5 个氨基酸的寡肽，而且也是一种定量定性分析的手段。流动相中的高浓度有机溶剂可以增强电喷雾离子源质谱的离子化效率，从而提高检测的灵敏度，与质谱具有很好的兼容性。

亲水色谱在分离提取氨基酸上已有成熟的应用。氨基酸在两性离子状态下，其羧基基团可发生电离被质子化，因此两性离子固定相常用于氨基酸的分离、纯化[38]。Pan 等[39]采用 HILIC-UPLC-MS/MS 法对 10 个板蓝根样品中的22 种游离氨基酸进行了分析，并取得了较好的分离效果。Yao 等[40]使用亲水作用高效液相色谱与电喷雾电离质谱联用（HILIC-UPLCESI-MS/MS）对银杏叶中 22 种游离氨基酸进行分离。

氨基酸成分的成熟应用能够为多肽、蛋白质成分的分离和鉴定奠定基础。Xu 等[41]采用 2D-RPLC/HILIC 对全蝎的蝎毒成分中肽类进行分割及纯化，并通过 MS 的方法进行结构鉴定，命名了两种新肽，为肽类的研究提供了新的依据。Zhou 等[42]采用 HILIC-UHPLC-QTRAP®/MS2 联合化学计量学的方法对罗汉果中的 27 种游离氨基酸、二肽和三肽类化合物进行了分析。但是，由于亲水作用色谱的保留机制尚没有统一定论，复杂的交互作用都可能对峰型有很大的影响。由于出峰次序与反向色谱不同，运用亲水色谱分离氨基酸或多肽时，其中某些有机溶剂可能会影响蛋白质的溶解度或性状。所以确定必要参数对保留化合物非常重要。

3 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析生物活性肽

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）是一种软电离质谱技术，其具有高灵敏度和高精确度等特点，为生命科学的研究提供强有力的技术支持。

2002年诺贝尔化学奖得主田中耕一（日）和约翰·贝内特（美）进一步发展了软电离法对生物大分子的鉴定和结构分析。

3.1 MALDI-TOF-MS 的应用原理

质谱的基本结构是离子源、质量分析器、离子检测器、数据分析和质谱谱图五个部分。其工作原理是将样品在离子源中电离，形成不同质荷比（M/Z）的离子，经电场加速进入质量分析器；在电场或磁场作用下，离子从质量分析器运行至离子检测器，经数据分析后绘出质谱图[43]。

MALDI-TOF-MS 的工作机制是在质谱系统的基础上进行了优化。MALDI 是在 1987年后正式确立的一种软电离方法，“软电离”就是指用较低的能量使分子电离。样品与基质形成共结晶后，吸收了脉冲激光中的部分能量而发生解吸，使样品离子化[44]。基质的作用就是分散样品分子，有利于把从激光中吸收的大部分能量快速传递给样品，促进样品离子化。

飞行时间质谱（TOF-MS）是一个真空的无场离子漂移管，当离子加速后进入漂移管，会以恒定的速度飞向离子接收器，接收器就会通过离子的质荷比与飞行时间所成的正比来测定样品的分子量。

3.2 MALDI-TOF-MS 分析生物活性肽的优势与应用前景

由于 MALDI-TOF-MS 使用的是软电离技术，使得样品分子在电离过程中不会破坏其结构，保证分子的完整性。在保证使用合适的基质时，理论的检测范围很宽，从 40 ～400 kD[45]，同时只需要很少的样品量就能够保证检测的灵敏度。MALDI-TOF 的优越性还体现在通过图谱能够直观地得到样品分子的质量，同时也可以得到高分子的末端基结构信息等。

在分析蛋白质结构的方法中，高效液相色谱（HPLC）或十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS- PAGE）是相对较成熟和有效的手段。随着质谱手段的发展，曾有研究人员比较了几种新型质谱技术，认为 MALDI 的灵敏度高，抗干扰能力强[46]。

孙宜君[47]采用 MALDI-TOF/TOF-MS 以及 LTQ 串联质谱的方法对螺旋藻抗菌肽 SP-1 的结构进行分析鉴定，最终确定 SP-1 为 18 个氨基酸（KLVD ASHRLATGDVAVRA）组成的阳离子小分子肽，分子量约为 1878.97 D。另有学者用 MALDI-TOF-MS 对羊胎盘抗氧化肽进行结构鉴定和氨基酸序列测定，得到一种由六个氨基酸组成的新肽，序列为Glu-Pro-Val-Ser-His-Phe，相对分子量为 678.6[48]。也有研究利用该方法鉴定坛紫菜活性肽，其中 M/Z = 1846.8613 的多肽氨基酸序列为 QTDDNHSNVLWAGFSR，另外两个质荷比为 1280.676 和 1677.879 的多肽序列分别为VPGTPKNLDSPR 和 MPAPSCALPRSVVPPR[49]。

4 展望

生物活性肽的研究发展迅猛，可见其功能的优越性以及人们需求的迫切性。但目前活性肽的研究还驻足在实验室阶段，研究人员需要利用更先进的手段来提取、纯化和鉴定各类多肽。为了能达到商业化生产和大批量供应，需要用临床试验数据来证明活性肽的功效，以及如何保证在人体内发挥效用而不被其他物质影响，同时还需要优化产品嗅味。这些都是我们今后进行攻关的目标，生物活性肽的发展是机遇和挑战并存的。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.012

010050 呼和浩特，内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心

苏秀兰，Email：xlsu@hotmail.com

2017-05-08