孙亚薇，白志超，朱秋雨，常玉梅

肿瘤坏死因子β及其相关疾病的研究进展

孙亚薇，白志超，朱秋雨，常玉梅

肿瘤坏死因子（TNF）超家族由 19 个成员组成，多数成员与相应受体结合为三聚体形式激活下游信号通路转导，从而参与一系列炎症和免疫反应。在肿瘤坏死因子超家族成员中，研究最为深入和广泛的是肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor α，TNFα），它与强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、炎症性肠炎、多发性硬化、银屑病、急性肝炎等疾病的发生具有重要关系[1-2]。肿瘤坏死因子 β（tumor necrosis factor β，TNFβ）是肿瘤坏死因子超家族的另一重要成员，可以膜结合形式（LTα1β2）或者游离形式（LTα3）存在[3]。和 TNFα 相似，游离形式的 TNFβ（LTα3）通过与肿瘤坏死因子 I 型受体（tumor necrosis factor receptor I，TNFRl）和肿瘤坏死因子 II 型受体（tumor necrosis factor receptor II，TNFR2）结合从而介导大部分信号转导，其激活后和TNFα 有某些共同的生物活性，其中最主要的是激活经典和非经典的 NF-κB 级联信号转导途径[4]。TNFβ 有广泛的生物活性，从调控二级淋巴器官的发育到调节对于特定微生物的免疫反应等过程都发挥了重要作用[5]。TNFβ 主要表达在CD4+I 型 T 辅助细胞（T helper cell 1，TH1）、CD8+细胞、NK 细胞、B 细胞和巨噬细胞。它在免疫系统的发生、发展和功能方面有特殊作用，尤其是在淋巴器官的发展，淋巴微环境的维持，宿主防御以及炎症方面有着非常重要的作用[6]。然而，许多证据指出这些作用来自基因缺陷小鼠，与人类本身 TNFβ 的相关性并不是十分明确。而且，这些动物模型使得确定 TNFβ 在以上这些系统中发挥的作用变得比较困难。这是由于 TNFβ 基因与 TNFα 基因、LTβ 基因密切相关联，并且靶向 TNFβ 基因可以导致旁系基因的损害[7]。而且，TNFβ 可以在一定程度上控制 TNFα 的表达，TNFβ 的缺失可以干扰 TNFα 的产生。同一种细胞类型可同时表达 TNFα 和 TNFβ，敲除两种细胞因子中任何一种基因的小鼠都可以表现出不同的表型特征，表明这两种细胞因子有着相似但又不同的功能。

1 肿瘤坏死因子 β 的信号转导途径

人的 TNFβ 位于 6 号染色体短臂 2 区 1 带，TNFβ以形成同源三聚体的形式和其受体结合，引发膜上受体的三聚化，进而引发下游一系列信号传导通路的激活。TNFβ 三聚体结合到其受体的胞外区后，肿瘤坏死因子受体相关死亡蛋白（tumor necrosis factor receptor associated death protein，TRADD）通过自身 C 端死亡结构域和 TNFRI 的死亡结构域结合，形成 TNFRI/TRADD 复合体，随后激活 Fas 相关死亡蛋白（Fas associated death protein，FADD），然后通过其死亡结构域和 Fas 相关死亡结构域蛋白样白介素 1β 转化酶（Fas associated death domain protein like interleukin 1β converting enzyme，FLICE）的死亡结构域相结合，进而激活下游的 caspase-3 和 caspase-9，最终导致细胞凋亡。进一步研究发现激活的 FLICE 能直接促使细胞色素 C 从线粒体释放到胞质，引发 caspase 活化级联反应，导致细胞死亡。在肿瘤坏死因子与其受体结合激活下游信号通路过程中，受体相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP）和 TRADD 通过各自的死亡结构域相互连接，诱导细胞坏死或者凋亡[8]。

2 肿瘤坏死因子 β 所致疾病

2.1 肿瘤坏死因子 β 与类风湿性关节炎

许多研究表明，TNFα 在多种疾病的发生发展过程中均发挥了重要作用，有文献表明有几种不同类型肿瘤细胞组成型表达 TNFα，其中包括卵巢癌、乳腺癌等[9]。TNFα 在多种肺部疾病中也起到了很重要的作用，例如哮喘、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤以及急性呼吸窘迫综合征等都有 TNFα 参与[10]。TNFα 还参与了自身免疫性疾病的发生发展。眼葡萄膜炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮以及克罗恩病的发生与多种肿瘤坏死因子超家族成员或者其受体的功能紊乱相关联[11]，阻断 TNFα 对于治疗骨关节炎以及克罗恩病都有显著效果。但关于 TNFβ 的研究则较少，近年研究发现它可能在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）中发挥了至关重要的作用。RA 是一类以关节损伤为主要特征的慢性免疫性疾病，TNFα 在改善 RA的过程中发挥了重要作用，阻断 TNFα 对于治疗 RA 病人非常有效[12]。然而，相当一部分病人对于抗 TNFα 治疗并不敏感并且出现了抵抗[13]。有报道，其他细胞因子参与到了 RA 的发生和发展，这可能导致了患者对于抗 TNFα 治疗的不敏感。通过对 RA 病人的样本进行酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、RT-PCR以及免疫组化分析得出 TNFβ 可能参与到了 RA 的发生发展过程中。报道发现，和骨性关节炎对照组相比，RA 病人血清和关节滑膜组织中的 TNFβ 水平显著升高[14-15]，并且单纯用特异性 TNFα 阻断剂英夫利昔治疗 RA 病人未见明显的临床疗效，后续对同一病人应用 TNFR2-Fc 融合蛋白伊纳西普治疗，同时阻断 TNFα 和 TNFβ，结果发现其病情有所缓解，这进一步表明了 TNFβ 和 RA 的关联性[16]。近来，Calmon-Hamaty 等[17]证明了在刺激 RA 发病的成纤维细胞样滑膜细胞增生过程中，TNFβ 和 TNFα 几乎发挥了同样重要的作用。用伊纳西普抑制两者的作用后，刺激指数均明显下降。另外，TNFβ 可以使 MAPK 下游信号通路中的 ERK、p38 发生磷酸化而激活，从而引起下游信号通路的激活，并最终导致了 RA 的发生。

2.2 肿瘤坏死因子 β 与移植物抗宿主病的发生

研究发现，TNFβ 还参与了移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）的发生和发展，所谓移植物抗宿主病，是由于移植物组织中的免疫活性细胞与组织不相融性抗原受者组织之间发生的免疫反应，可导致受者皮肤、肝脏和消化道细胞坏死，严重者可引起广泛的肠道黏膜和皮肤脱落，对真菌和细菌感染的易感性增高，从而发生致命性感染。GVHD 是骨髓移植的主要障碍，也是骨髓移植后主要并发症和死亡原因。2010年，Markey 等[18]发现可溶性的 TNFβ 在 GVHD 的过程中是不可或缺的分子。他们的研究发现在 TNFα 缺失的情况下，TNFR-Fc 嵌合受体仍可以对 GVHD 有一定的保护作用，说明在 GVHD 的发生过程中，还有其他细胞因子在发挥着作用。将 TNFβ 敲除的 B6 鼠的骨髓移植到 BALB/c 小鼠体内后，发现移植TNFβ 敲除鼠的实验组存活率更高，发生 GVHD 的机率大大降低，这提示供者来源的细胞产生的 TNFβ 是 GVHD发生的重要原因之一。Chiang 等[19]发现在 GVHD 的异体基因移植模型中，TNFβ 上调激活人类供者的淋巴细胞，并且靶向敲除这些供者细胞能够改善 GVHD 的发生情况。MLTA3698A 是一个能够特异性中和可溶性和膜结合型TNFβ 的单克隆抗体，在体外可以发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cellularcytotoxicity，ADCC）。利用 GVHD 的人源化 SCID（Hu-SCID）小鼠模型，MLTA3698A 特异性清除了供者 TNFβ 阳性表达的 T、B 淋巴细胞，从而延长了小鼠的生存期。这些研究为免疫性疾病如 GVHD 甚至是自身免疫性疾病的治疗都提供了一些依据。

2.3 肿瘤坏死因子 β 与其他疾病发生发展之间的关系

有研究表明，TNFβ 通过 TNFR 介导了派尔集合淋巴结的形成[20]，其依据是 TNFR-/- 小鼠的派尔集合淋巴结完全缺乏或者不正常，而 TNFα-/- 的小鼠却有正常的派尔集合淋巴结[21]。有些文献表明，TNFβ 在对抗特定感染方面起到了一定的宿主防御作用，比如 TNFβ 缺陷的小鼠对金黄色葡萄球菌高度易感[22]。Pamir 等[23]分别用高脂肪高糖饮食饲喂野生型小鼠和 TNFβ-/- 小鼠，结果发现，在 13 周的高脂肪高糖饮食后，和野生型小鼠相比，TNFβ-/- 小鼠体重降低 20%，并且糖耐量提高，表明野生型小鼠中 TNFβ可能参与损害糖代谢过程。Zhang 等[24]研究表明 TNFα 和TNFβ 的过度表达分别导致了急性心肌梗死后的早期和晚期的心脏功能紊乱，并且TNFα 和 TNFβ 介导的这种心肌梗死后心脏功能紊乱均是通过 TNFR1 来发挥作用，而TNFR2 的激活则具有心肌保护作用。Veiga-Parga 等[25]发现单纯疱疹病毒 1 感染眼部可导致基质角膜炎的发生，TNFβ在这种角膜炎的发生中起到了重要作用。研究发现，感染后48 h，TNFβ 转录水平显著提高。利用角膜的基质成纤维细胞系进行实验，发现 TNFβ 通过激活细胞因子的产生促进炎症的发生。提前用抗 TNFβ 单克隆抗体中和小鼠的TNFβ 显著减轻了角膜损害。

3 肿瘤坏死因子抑制剂研究现状

3.1 大分子抑制剂

目前为止，已有三种针对肿瘤坏死因子的大分子抑制剂被美国 FDA 批准上市，其中，英夫利昔单抗是第一个批准上市的抗 TNFα 的药物，自 1998年首次应用于临床以来，已经成为治疗风湿性关节炎等炎症性疾病的首选药物。另外，还有一些抗 TNFα 的单克隆抗体，如 2003年批准上市的阿达木单抗，以及 2009年上市的戈利木单抗等。然而，这些大分子抑制剂出现了许多不良反应，如恶性肿瘤，细菌、病毒和真菌引发的感染，药物的免疫反应，皮肤的过敏反应等。随着肿瘤坏死因子大分子抑制剂出现的这些不良反应逐渐显现，研究开始聚焦于靶向肿瘤坏死因子信号通路的小分子化合物。它们具有一些潜在的优势，如减少免疫抑制、提高组织穿透力、易于工业化生产、成本较低等。

3.2 小分子抑制剂

除了上述的大分子抑制剂外，目前，也有一些针对肿瘤坏死因子下游信号通路中某些分子的小分子抑制剂的研究，例如在 RA 的治疗过程中，有一种称为缓解病情抗风湿药（disease-modifying anti-rheumatic drug，DMARDs）的小分子二线药物，由于其分子靶点和免疫调节机制还不清楚，很多研究便转到靶向特异性信号通路或扰乱细胞激活机制的小分子抑制剂（small molecular inhibitors，SMIs）上来[26]，如 p38 抑制剂便是靶向特异性信号通路的一种小分子抑制剂。研究发现缺乏 p38γ 和 p38δ 的复合物显著地降低了胶原诱导的关节炎和炎症分子前体的表达，这些炎症分子包括白细胞介素-1 和 TNFα 等，然而这也只是发挥了中介的抑制效果，并未从根本上抑制这些炎症细胞因子的产生[27]。有大量积累研究指出在 p38 的所有同型异构体中，p38α 可能是最重要的炎症应答因子。许多有效的具有抗炎活性的p38α 抑制剂被开发出来，并且其中至少有 22 种已经进入了 I/II 期临床试验用于自身免疫性疾病的治疗。然而由于极其有限的临床效果和潜在的毒副作用，例如肝毒性、严重感染的发生、胃肠功能紊乱以及中枢神经系统功能紊乱等，使得这些药物未进入到 III 期临床试验便宣告终止[28-31]。虽然 p38 抑制剂在治疗类风湿性关节炎的过程中以失败告终，但它们在治疗其他疾病时却有比较好的医学价值。

在导致 MAPK 和 NF-κB 信号通路激活的前体炎症分子中，JAKs 家族成员，包括 JAK1、JAK2、JAK3 和Tyk2[32]发挥了关键的作用。托法替尼是靶向特异性信号通路小分子抑制剂的又一个代表，它是靶向 JAKs 家族的一种特异性小分子抑制剂。托法替尼能显著地改善 RA 病人的症状而且能够提高病人的生理功能[33]。2012年11月6日，美国食品和药物管理局（FDA）通过危险评估和减轻策略（risk evaluation and mitigation strategy，REMS）批准了 JAK 抑制剂托法替尼用于治疗成人活动期以及对甲氨蝶呤反应不佳的中至重度 RA 患者，但其特异性比较差，不良反应仍然较大。

近些年来寻找更安全和有效的小分子抑制剂的工作依旧继续，小分子抑制剂的潜在靶分子也逐渐被报道出来。有文献报道，通过计算机虚拟筛选结合药物设计的方法，发现一个小分子化合物—— (E)-4-(2-(4-chloro-3-nitrophenyl)，其能够和 TNFα 直接结合，而且能抑制 TNFα 下游信号通路的激活[34]。还有一种 TNFα 转化酶（TNFα converting enzyme，TACE）的药物，它是一种锌依赖的特异性基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），能够将膜结合型的肿瘤坏死因子剪切变为游离状态。转录后，肿瘤坏死因子先被翻译成一个前体蛋白，此蛋白含有一段较长的信号肽序列，帮助其固定在细胞外侧膜上。在发生炎症反应时，TACE 行使其切割功能产生可溶型肿瘤坏死因子。马马司他是广谱的 TACE 和基质金属蛋白酶抑制剂，能够抑制脂多糖介导的可溶型肿瘤坏死因子的表达，从而发挥抑制作用。然而膜结合型肿瘤坏死因子在多种疾病的发生发展过程中也有重要作用，故而单一靶向抑制 TACE 的药物也有其局限性。

4 结束语

研究人员曾认为 TNFβ 的作用次于 TNFα，因此与其有关的研究非常少，然而近年来很多研究都证明了 TNFβ在许多疾病的发生中都有很重要的作用。目前只有很少一部分抑制 TNFα 作用的受体样大分子药物在抑制 TNFα 的同时也能够抑制 TNFβ 的作用，例如伊纳西普，它是由人IgGl 的 Fc 段和 TNFR2 胞外部分二聚体组成的一个融合蛋白，能够同时抑制两者的功能。虽然大分子药物具有某些明显的优势，比如临床疗效明显、半衰期长、靶向性强等，然而亦有很多难以改进的缺点，经常有文献报道这些大分子药物由于免疫原性强导致机体免疫损害，另外还可导致感染、肿瘤等，其中不良反应发生率最高的表现为感染。Raychaudhuri 等[35]发现，感染率升高与这些大分子抑制剂的应用密切相关。另外，感染的类型多种多样，例如球孢子菌病、机会感染以及结核病等。因此，研发特异性针对 TNFβ的小分子抑制剂变得十分重要。

在临床使用中，各类肿瘤坏死因子的小分子抑制剂对RA 以及其他慢性炎症反应性疾病表现出了较好的应用前景，功能方面也有很多差异，因此希望研制出更加安全并且有效的肿瘤坏死因子抑制剂，同时扩展药物的适应证也是研究的重点。

[1]Davis JM, Colangelo J.Small-molecule inhibitors of the interaction between TNF and TNFR.Future Med Chem, 2013, 5(1):69-79.

[2]Buhrmann C, Shayan P, Aggarwal BB, et al.Evidence that TNFβ(lymphotoxinα) can activate the inflammatory environment in human Chondrocytes.Arthritis Res Ther, 2013, 15(6):R202.

[3]Fhu CW, Graham AM, Yap CT, et al.Reed-sternberg cell-derived lymphotoxin α activates endothelial cells to enhance T-cell recruitment in classical Hodgkin lymphoma.Blood, 2014, 124(19):2973-2982.

[4]Haybaeck J, Zeller N, Wolf MJ, et al.A lymphotoxin-driven pathway to hepatocellular carcinoma.Cancer Cell, 2014, 16(4):295-308.

[5]Upadhyay V, Fu YX.Lymphotoxin signalling in immune homeostasis and the control of microorganisms.Nat Rev Immunol, 2013, 13(4):270-279.

[6]Ware CF.Network communications: lymphotoxins, LIGHT, and TNF.Annu Rev Immunol, 2005, 23:787-819.

[7]Kuprash DV, Alimzhanov MB, Tumanov AV, et a1.Redundancy in tumor necrosis factor (TNF) and lymphotoxin (LT) signaling in vivo:mice with inactivation of the entire TNF/LT locus versus single-knockout mice.Mol Cell Biol, 2002, 22(24):8626-8634.

[8]Chu WM.Tumor necrosis factor.Cancer Lett, 2013, 328(2):222-225.

[9]Aggarwal BB, Shishodia S, Sandur SK, et al.Inflammation and cancer:how hot is the link? Biochem Pharmacol, 2006, 72(11):1605-1621.

[10]Matera MG, Calzetta L, Cazzola M.TNF-alpha inhibitors in asthma and COPD: we must not throw the baby out with the bath water.Pulm Pharmacol Ther, 2010, 23(2):121-128.

[11]Vinay DS, Kwon BS.The tumour necrosis factor/TNF receptor superfamily: therapeutic targets in autoimmune diseases.Clin Exp Immunol, 2011, 164(2):145-157.

[12]McKellar GE, McCarey DW, Sattar N, et al.Role for TNF in atherosclerosis? Lessons from autoimmune disease.Nat Rev Cardio,2009, 6(6):410-417.

[13]Soliman MM, Ashcroft DM, Watson KD, et al.Impact of concomitant use of DMARDs on the persistence with anti-TNF therapies in patients with rheumatoid arthritis: results from the British Society for Rheumatology Biologics Register.Ann Rheum Dis, 2011, 70(4):583-589.

[14]Robak T, Gladalska A, Stepien H.The tumour necrosis factor family of receptors/ligands in the serum of patients with rheumatoid arthritis.Eur Cytokine Netw, 1998, 9(2):145-154.

[15]O'Rourke KP, O'Donoghue G, Adams C, et al.High levels of Lymphotoxin-Beta (LT-Beta) gene expression in rheumatoid arthritis synovium: clinical and cytokine correlations.Rheumatol Int, 2008,28(10):979-986.

[16]Buch MH, Conaghan PG, Quinn MA, et al.True infliximab resistance in rheumatoid arthritis: a role for lymphotoxin alpha? Ann Rheum Dis,2004, 63(10):1344-1346.

[17]Calmon-Hamaty F, Combe B, Hahne M, et al.Lymphotoxin α revisited: general features and implications in rheumatoid arthritis.Arthritis Res Ther, 2011, 13(4):232.

[18]Markey KA, Burman AC, Banovic T, et al.Soluble lymphotoxin is an important effector molecular in GVHD and GVL.Blood, 2010, 115(1):122-132.

[19]Chiang EY, Kolumam G, McCutcheon KM, et al.In vivo depletion of lymphotoxin-alpha expressing lymphocytes inhibits xenogeneic graft-versus-host- disease.PLoS One, 2012, 7(3):e33106.

[20]Fu YX, Chaplin DD.Development and maturation of secondary lymphoid tissues.Annu Rev Immunol, 1999, 17:399-433.

[21]Neumann B, Luz A, Pfeffer K, et al.Defective Peyer's patch organogenesis in mice lacking the 55-kD receptor for tumor necrosis factor.J Exp Med, 1996, 184(1):259-264.

[22]Hultgren O, Eugster HP, Sedgwick JD, et al.TNF/lymphotox in-alpha double-mutant mice resist septic arthritis but display increased mortality in response to Staphylococcus aureus.J Immunol, 1998,161(11):5937-5942.

[23]Pamir N, McMillen TS, Edgel KA, et al.Deficiency of lymphotoxin-α does not exacerbate high-fat diet-induced obesity but does enhance inflammation in mice.Am J Physiol Endocrinol Metab, 2012, 302(8):E961-E971.

[24]Zhang Y, Zhao J, Lau WB, et al.Tumor necrosis factor-α and lymphotoxin-α mediate myocardial ischemic injury via TNF receptor 1, but are cardioprotective when activating TNF receptor 2.PLoS One,2013, 8(5):e60227.

[25]Veiga-Parga T, Giménez F, Mulik S, et al.Controlling herpetic stromal keratitis by modulating lymphotoxin-alpha-mediated inflammatory pathways.Microbes Infect, 2013, 15(10-11):677-687.

[26]O'Shea JJ, Laurence A, McInnes IB.Back to the future: oral targeted therapy for RA and other autoimmune diseases.Nat Rev Rheumatol,2013, 9(3):173-182.

[27]Criado G, Risco A, Alsina-Beauchamp D, et al.Alternative p38 MAPKs are essential for collagen-induced arthritis.Arthritis Rheumatol, 2014, 66(5):1208-1217.

[28]Damjanov N, Kauffman RS, Spencer-Green GT.Efficacy,pharmacodynamics, and safety of VX-702, a novel p38 MAPK inhibitor, in rheumatoid arthritis: results of two randomized,double-blind, placebo-controlled clinical studies.Arthritis Rheum,2009, 60(5):1232-1241.

[29]Goldstein DM, Kuglstatter A, Lou Y, et al.Selective p38alpha inhibitors clinically evaluated for the treatment of chronic inflammatory disorders.J Med Chem, 2010, 53(6):2345-2353.

[30]Hammaker D, Firestein GS."Go upstream, young man": lessons learned from the p38 saga.Ann Rheum Dis, 2010, 69 Suppl 1:i77-i82.

[31]Terajima M, Inoue T, Magari K, et al.Anti-inflammatory effect and selectivity profile of AS1940477, a novel and potent p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor.Eur J Pharmaco1, 2013,698(1-3):455-462.

[32]Bezbradica JS, Medzhitov R.Integration of cytokine and heterologous receptor signaling pathways.Nat Immunol, 2009, 10(4):333-339.

[33]Fleischmann R, Kremer J, Cush J, et al.Placebo-controlled trial of tofacitinib monotherapy in rheumatoid arthritis.N Engl J Med, 2012,367(6):495-507.

[34]Ma L, Gong H, Zhu H, et al.A novel small-molecule tumor necrosis factor α inhibitor attenuates inflammation in a hepatitis mouse model.J Biol Chem, 2014, 289(18):12457-12466.

[35]Raychaudhuri SP, Nguyen CT, Raychaudhuri SK, et al.Incidence and nature of infectious disease in patients treated with anti-TNF agents.Autoimmu Rev, 2009, 9(2):67-81.

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.013

中国人民解放军第二五二医院院管课题科研基金（2013252yy59）

071000 保定，解放军二五二医院中心实验室

常玉梅，Email：centerlab252@163.com

2017-06-05