邱吉妮 张朝然

·综 述·

口腔黏膜上皮细胞片移植治疗角膜缘干细胞缺损的基础研究及临床应用

邱吉妮 张朝然

角膜缘干细胞为正常角膜上皮的自我更新提供了来源，在维持眼表稳态中起到了极为重要的作用。近年来，随着对成体干细胞认识的加深以及生物组织工程学的发展，培养的口腔黏膜细胞片移植已成为治疗角膜缘干细胞缺损的方法之一。本文就其培养方法、细胞片表型及临床应用结果的进展进行综述。(中国眼耳鼻喉科杂志，2017，17：140-142,149)

角膜缘干细胞缺损；口腔黏膜上皮细胞；载体；表型特征;最佳矫正视力；新生血管化

健康稳定的眼表保护眼睛免受外伤、感染和干燥的损害，对维持良好的视力至关重要。眼表上皮由结膜、角膜缘和角膜3种特异的上皮细胞构成。角膜缘干细胞可不断分化并形成角膜上皮细胞，为多层的、非角化的角膜上皮再生提供来源。

化学伤、热灼伤、Steven-Johnson综合征(Steven-Johnson syndrome)以及眼瘢痕性类天疱疮等疾病都可导致角膜缘干细胞缺损(limbal stem cell deficiency，LSCD)，其结果是结膜上皮侵入角膜，临床表现为持续的角膜上皮缺损，角膜基质混浊以及新生血管化等一系列病变。疼痛、畏光、干眼、视力下降甚至失明等极大地影响了角膜缘干细胞缺损患者的生活质量。由于LSCD患者多同时伴有眼表的慢性炎症和干眼，这使得LSCD患者角膜移植的风险大大增加，或者说LSCD是角膜移植手术的禁忌证。因此重建角膜缘干细胞的功能，是重建眼表的关键步骤。

角膜缘干细胞重建的方法主要分为：自体或同种异体角膜缘移植，基于组织工程技术体外培养的细胞片移植。对于双侧LSCD患者而言，并无自体角膜缘供体行自体角膜缘移植或培养的角膜缘细胞片移植，而同种异体角膜缘移植或培养的异体角膜缘上皮移植有很大的免疫排斥风险，即便使用免疫抑制剂，异体角膜缘细胞片移植的成功率依然很低[1]。为了解决这些问题，包括结膜、口腔黏膜、鼻黏膜、头发毛囊以及牙髓在内的等多种自体组织都用来研究以替代角膜缘作为供体材料。其中，口腔黏膜上皮细胞(oral mucosal epithelial cell, OMEC)片能够在体外维持其干细胞特性，并能够表达CK3,CK19,Ki-67,p63,p75等角膜上皮标记物。既避免了异体移植可能发生的排斥以及使用免疫抑制剂和糖皮质激素伴随的并发症等问题，同时适用于单侧和双侧LSCD。而且口腔黏膜上皮细胞容易取得，所需的黏膜组织很小，通过局部麻醉即可获得，操作伤害小，伤口1周内可无瘢痕痊愈。在动物实验及临床试验中都取得了满意的效果[2-3]。

1 口腔黏膜体外培养方法

1.1 细胞片载体选择 载体是细胞增殖的场所，同时引导细胞生长，决定着所构建组织的形态，在OMEC培养、细胞片移植及之后的转归中都发挥着巨大作用。合适的载体需要同时满足光学透明、生物性兼容、无菌、硬度适合等多个条件。

羊膜具有免疫原性低、抗新生血管、可抑制成纤维化和减少瘢痕等特点，已经作为常规载体用于OMEC片的构建[4]。但羊膜与上皮细胞黏附率较低，细胞易从羊膜上脱落，移植后羊膜组织溶解吸收较慢，影响种子细胞与角膜基质黏附生长及角膜组织的透明。而且羊膜本身的质量不一，透明度有限，具有潜在的医源性感染的风险。这些缺点限制了羊膜进一步的临床应用。

随着组织工程学的发展，近来各种生物材料在介导细胞附着生长、促进细胞增殖和分化、维持干细胞活性及操作方便等方面都有不断的突破与改进。胶原、纤维蛋白凝胶、接触镜、聚己内酯、丝蛋白、聚甲基丙烯酸酯、角蛋白、明胶壳聚糖、聚乳酸-羟基乙酸、聚乙二醇等多种材料作为细胞片载体的研究进展不一，多数仍处于体外实验阶段。近期研究[5]发现，聚己内酯经过等离子处理后生物兼容性和光学透明度极大改善，尚无体内实验的报道。等离子聚合体包被的接触镜为细胞载体能够增加细胞的附着和增殖，首次报道在动物实验中转移后的细胞能够存活并能帮助部分眼表重建[6]。但其所选择的种子细胞多为角膜缘或角膜上皮细胞，在今后的研究中或许也将用于口腔黏膜上皮细胞的培养。

无载体的温度敏感培养法[7]和纤维蛋白胶原培养法[8]在当下培养OMEC中广泛应用，已经在多个临床试验中证明了其可行性，其手术本身也并不要使用缝线，从而大大加速手术进程。由于无载体的细胞片直接与角膜基质相接触，上皮和基质之间的连接更为紧密，可以提高术后细胞片的生存率，减少新生血管的产生，提高患者术后的视力。但通过羊膜载体细胞片与无载体细胞片的细胞增殖情况比较发现，前者BrdU细胞阳性率较高，而Ki67细胞阳性率较低，说明羊膜可能对维持上皮细胞处于低分化状态有一定作用[9]。

1.2 饲细胞及血清的取舍 当前,口腔黏膜上皮移植(cultured oral mucosal epithelial transplantation, COMET)细胞的体外培养多用胎牛血清和鼠源性的3T3细胞作为饲细胞的培养体系。以Rheinwald和Green在1975年创立的利用经6 Gry Y射线照射失去增殖能力的鼠3T3细胞作为滋养层细胞的方法为代表,其特征是3T3细胞滋养层和使用含胎牛血清的培养液。这种细胞培养体系需血清、涂层板和细胞滋养层，成本较高，操作繁琐，其本身就包含着传播致病菌、免疫反应和移植排斥的风险，且达不到生产质量管理规范(good manufacturing practice, GMP)的要求。有学者[10]发现皮肤成纤维细胞可以替代3T3作为饲细胞培养口腔黏膜细胞，研究表明皮肤成纤维细胞可以在细胞传代时维持其干细胞特点，有效性好于3T3细胞。

自体血清也可以用来培养口腔黏膜上皮细胞，但在使用的同时伴随着传播病毒感染的潜在风险。而且，血清在培养基中的作用是非常复杂的，由于血清成分的多样性使细胞培养条件的标准难以确定。由于培养基中血清的存在，也影响了所需细胞特点的检测[11]。近来，有研究[12]报道了无血清的确定型培养基培养OMEC的可行性。之后，Kolli 等[13]以羊膜为载体，使用无动物源物质的培养基培养OMEC片，并应用于化学伤导致的LSCD患者取得了较好的效果。Sheth等[8]报道了以纤维蛋白凝胶为载体，不依赖于3T3的OMEC培养。这些研究都在一定程度上提高了上皮细胞片培养材料的可靠性和安全性，但尚处于初步探索阶段，之后较大规模的动物实验、临床试验及临床应用有待证实。符合GMP的细胞培养方法仍未规范统一。研究符合GMP要求的无载体无血清的确定型培养基是未来COMET的发展方向。

2 细胞片及其临床效果评估

2.1 细胞片表型 OMEC起源于口腔黏膜，在用于分化角膜上皮细胞时，首先要证实所培养细胞片上具有分化能力的干细胞存在，并能够保持其再生功能，确保角膜上皮细胞的更新。其次，细胞片的完整性在于细胞连接，其在细胞交换和细胞稳定中起到重要作用。第三，细胞片抗新生血管因子对于减少角膜新生血管化，确保细胞片移植的存活率十分重要。

Sen等[14]发现OMEC表达非角化上皮细胞的分子标志物K4和K13，这说明OMEC有形成类似于角膜上皮细胞的多层上皮细胞细胞片的能力。OMEC培养的细胞片是多层的，包括细胞核较大，核质比较高的能够快速增殖并分化的圆形小细胞和细胞核较小，核质比较大的分化成熟的上皮细胞。分子生物学标记物同样证明了细胞片中既包含具有干细胞潜能的细胞，又包含成熟的上皮细胞。通过扫描电镜观察OMEC发现，细胞间如正常的角膜上皮细胞间一样，存在细胞与细胞间的连接桥粒。同时，首次观察到培养的OMEC中含有黏蛋白颗粒[14]。这些发现都证实了体外培养的OMEC具有增殖分化能力，并能够形成细胞连接，还具有减轻黏液缺损，缓急眼表疾病相关的干眼状态的潜能。

Bardag-Gorce等[15]用温度敏感法培养兔OMEC片，并使用微阵列分析研究了细胞片的基因表达，证实了细胞片上干细胞的存在。并发现细胞片细胞外基质的MMP-1，MMP-3,MMP-12等促进新生血管因子的基因表达下调，细胞间隙连接蛋白A7和保护角膜免受紫外线辐射的ALDH1A1等基因表达上调，说明了COMET用于LSCD的可靠性。这些研究证实了OMEC具有再生能力，良好的细胞交换作用，有能够促进细胞黏附和抗新生血管形成的细胞外基质。

2.2 细胞片在眼表的结构重建 COMET术后存在于眼表的口腔黏膜上皮细胞片是否分化成角膜上皮细胞以及是否维持其增殖分化的能力是近期的热点之一。Soma等[16]在对大鼠模型中的研究中发现，COMET术后细胞片维持了上皮干细胞增殖分化能力，同正常眼表角膜干细胞的分布相同。细胞片的干细胞多存在于角膜外周，其机制有待进一步研究。

Sugiyama等[17]在对动物模型COMET术后研究发现，移植后的OMEC全层均表达有角蛋白K14和干细胞标志物p63。而它们存在于正常角膜缘基底上皮细胞而非正常角膜上皮细胞。其中1例OMEC在不同位置观察到有K4和角膜上皮特异性标志物K12的表达。Chen等[18]报道了4例COMET术后角膜上皮免疫荧光染色的结果，发现4例角膜上皮均具有干细胞增殖分化能力，并表达口腔黏膜上皮分化特异性标志物K13，其中仅1例角膜周边局部出现角膜上皮分化特异性标志物K12，说明COMET术后移植到眼表的OMEC依然偏向分化为OMEC。最近，Gaddipati等[19]对1例COMET术后11个月的角膜上皮研究,证实了之前对干细胞和口腔黏膜上皮标志物的发现。该研究还发现角膜上皮胞质中表达K12，胞核中表达PAX6，这些是角膜上皮细胞特有的标志物，说明培养的(cultured OMEC, COMEC)在COMET术后维持OMEC特点的同时获得了角膜上皮样特征。目前此类研究的病例数仍比较少，检测时间不一，COMET术后干细胞、OMEC、角膜上皮细胞出现及能够维持的时间有待进一步研究。

2.3 细胞片在眼表的功能重建 总的来说，尽管在角膜周边区域有一定程度的新生血管形成，COMET在临床中已经取得较好的中长期效果。同时，培养的OMEC片表达黏蛋白，可以减轻黏液缺损，缓解眼表疾病相关的干眼状态[14]。Nakamura等[20]报道了对19例患眼至少随访36个月，其中10例患者视力有所恢复，在重建穹隆功能和解除睑球粘连方面也非常有效。Satake等[21]报道了对40例眼平均25.5个月随访，1年时，64.8%患眼角膜表面稳定，2年为53.1%，3年为53.1%。近来，Dobrowolsk等[22]在对无虹膜患者COMET术后观察发现，88.2%的患眼视力有所提高。

不同与之前无载体细胞片较羊膜载体细胞片来说更加易碎的预想，通过对胶原纤维凝胶的无载体细胞片与羊膜载体细胞片做比较，Kaplan-Meier分析表明无载体细胞片生存率明显高于羊膜载体细胞片，新生血管程度低于羊膜载体组，其术后最佳矫正视力(best corrected visual acuity，BCVA)也明显好于羊膜载体细胞片[23]，与之前动物实验[9]观察到无载体组细胞片光学透明高于羊膜组的结果一致。尚无长期的临床试验观察到,在COMET术后较长的时间内有无羊膜载体影响上皮细胞的增殖状态。Sotozono等[24]对多种病因引起的LSCD患者COMET术后视力的多元回归曲线分析，表明术后角膜新生血管化和睑球粘连与BCVA明显相关。LSCD患者的长期视力得到提高，即使是对于严重的眼表疾病伴随严重的泪液缺乏患者，COMET可以极大改善其视力。

COMET失败的主要原因是持续的上皮缺损(persistent epithelial deficiency，PED)和角膜表面纤维和新生血管化。PED和术前PED状态相关。虽然COMEC细胞外基质的MMP-1，MMP-3,MMP-12等促进新生血管因子的基因表达下调，而且COMEC与培养的角膜上皮细胞片相比，它们表达的血管生成抑素，FGF-2，Flt-1，VEGFR-2和VEGF并无明显差别，但是内皮抑素，PEDF和TSP-1等抗血管生成因子在COMEC中明显少于后者。Chen等[25]对COMET术后的角膜进行了一系列血管生成相关因子的检测发现，sF1t-1、TIMP-3和TSP-1这些抗血管生成因子的缺乏可能与COMET术后新生血管化密切相关，还提出新生血管化的程度可能与细胞分化的程度有关。Bardag-Gorce等[2]对LSCD动物模型COMET术后6个月的角膜进行组织学分析发现，抗血管生成因子TIMP-3表达升高，而血管生成因子MMP-3表达降低可能是新生血管化降低的原因。由于COMET术后角膜材料不易获得，对临床新生血管化的病例研究较少，影响COMET术后新生血管化的血管生成相关因子和具体机制尚未明确，但抗新生血管治疗可以作为COMET术后防止外周新生血管长入的方法来提高COMET术后效果[26]。

3 展望

目前，COMET在临床上取得良好的效果，具有临床应用的理论基础，能有效地用于治疗LSCD。但COMET术后OMEC片是否能够完全表达角膜上皮细胞的结构特点，是否能够达到正常角膜上皮所具有的功能，以及其具有一定结构和功能所需的时间和能够维持的时间都尚未明确。角膜新生血管长入及影响其长入程度的机制也未能明确，这些问题都对于COMET的成功应用和患者的预后十分重要。在当前的COMET临床研究中，病例数较少，眼表情况不一，还需要通过严格的病例对照和病例研究来帮助我们对不同患者有明确的评估并确定适宜的个体化治疗方法。建立完善的、符合GMP标准的无载体的确定型培养基培养的OMEC片，减少术后新生血管生成和其他并发症，为患者提供个体化治疗，是我们今后努力的方向。

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(本文编辑 诸静英)

Update on cultivate oral epithelial cells sheet for limbal stem cell deficiency

QIUJi-ni,ZHANGChao-ran.

DepartmentofOphthalmology,EyeEarNoseandThroatHospitalofFudanUniversity,Shanghai200031,China

ZHANG Chao-ran, Email: fdeent@126.com

Limbal stem cell (LSC), which is the source of the corneal epithelium cell, plays an important role in the ocular surface. In recent decades, with the development of stem cell application and tissue engineering, cultivated oral epithelial cells sheet transplantation (COMET) has become an alternative for LSC deficiency. In this review, the cultivated methods, cell phenotypic characteristics of the cells sheet, as well as the clinical results of COMET in recent years were summarized. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:140-142,149)

Limbal stem cell deficiency; Oral mucosal epithelial cell; Carriers; Phenotypic characteristics; Best corrected vision acuity; Neovascularization

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031

张朝然(Email:fdeent@126.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.02.020

2016-01-13)