王江涛，李春宝，步建立，安明扬，袁 伟，张加廷，肇 刚，朱娟丽，李众利，刘玉杰

1解放军总医院第四医学中心 骨科医学部，北京 100853；2 解放军第 980医院 骨一科，河北石家庄 050000

肌腱损伤是最常见的临床疾病之一，占所有损伤性疾病的30%[1]。肌腱粘连、肌腱愈合差导致的再断裂、腱骨不愈合等严重影响肌腱损伤修复术的临床疗效，是尚未解决的难题[2-5]。人羊膜作为一种胚胎源性组织，免疫原性低，富含多种生物活性物质，具有抑制炎症反应、促进组织修复的潜在作用。近年来，国内外多项研究表明人羊膜在创面修复、神经损伤修复、骨软骨损伤修复和肌腱损伤修复等方面有重要的作用[6-11]。也有研究报道人羊膜与传统修复技术相比在肌腱损伤修复的早期并不能产生更好的治疗效果[12]。本文旨在通过探讨人羊膜在肌腱损伤修复中的作用，为临床预防肌腱粘连、促进肌腱和腱骨愈合提供参考。

1 人羊膜的结构和功能

1.1 人羊膜的结构 人羊膜是一种胚胎源性组织，厚度为0.02 ～ 0.5 mm，半透明状，无神经、淋巴管和肌肉[13]。根据解剖位置不同，人羊膜可分为胎盘羊膜、反应羊膜和脐带羊膜，胎盘羊膜覆盖胎盘表面，反应羊膜沿子宫壁分布，脐带羊膜位于脐带部位[14]。人羊膜主要分为3层结构，内层为上皮细胞层，与羊水接触，中间层为基底层，外层为间质组织层，与绒毛膜相连。间质组织层由内向外又分为致密层、成纤维细胞层和海绵层[13-15]。上皮细胞层由立方上皮细胞(反应羊膜)或柱状上皮细胞(胎盘羊膜)构成，与基底层紧密相连，可分泌转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、TGF-β2和表皮生长因子等多种细胞生长因子[14]。基底层致密，厚实，含有大量层粘连蛋白、纤连蛋白和Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型胶原蛋白，是保护羊水和胎儿的物理屏障[13,15]。间质组织层含有大量胶原纤维，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型胶原纤维，距离胎盘越近的胶原纤维呈平行排列，距离胎盘越远的胶原纤维垂直羊膜表面排列[16]。间质组织层内含有间充质干细胞，具有多向分化潜能，是用于组织修复的重要基础[17-18]。

1.2 人羊膜的功能 人羊膜的功能包括为胎儿提供物理保护屏障、转运水和可溶性营养物质，调节羊水的酸碱平衡，合成并分泌多种细胞信号和生物活性物质，发挥抗菌、抗感染、防粘连和促修复的作用[13,19-20]。人羊膜分泌的生物活性物质包括成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、血小板源性生长因子、白细胞介素-1、白细胞介素-10等[12,18]。此外，人羊膜还可分泌白细胞介素-1和白细胞介素-10的拮抗剂，以及降解酶的调控物质(TIMPs 1/2/3/4)[20]。人羊膜还可下调TGF-β信号通路，招募成纤维细胞和巨噬细胞，促进胶原纤维生成[20]。反应羊膜比胎盘羊膜表达更多的免疫调节表面活性蛋白-D，具有更大的免疫调节潜能[14]。胎盘羊膜可分泌更多的胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子b、血管生成素等生长因子，促组织修复功能优于反应羊膜[14]。组织再生修复是一个能量消耗的过程。胎盘羊膜的线粒体活性更高，能产生更高的能量，更适合用于代谢活跃部位的组织修复[21]。

2 人羊膜的保存

根据保存方式的不同，人羊膜可分为新鲜羊膜、低温冷冻羊膜、冻干羊膜 3种[20,22]。这3 种羊膜均保留了细胞成分和基质成分，羊膜的整体性未被破坏。新鲜羊膜保存时间较短，而且可引起较轻的机体炎症反应[23-24]。低温冷冻羊膜保存时间较新鲜羊膜长，但会影响干细胞的活力[25]。为此，需要将羊膜放入10% DMSO或50%甘油溶液中并置于-80℃下保存[25-26]。冻干羊膜对保存的条件要求相对最低，可常温条件下长期保存[20,22,27]。研究表明，冻干羊膜与低温冷冻羊膜相比，在细胞活性和基质成分方面无显著差异，在安全性、保存时间、移植存活率等方面具有优势，易于处理和运输[28]。此外，还有一种脱细胞羊膜，它是使用酶消化法、化学去污法和物理刮除等方法，脱去了羊膜上皮细胞或所有细胞成分后的组织形态，免疫原性更低，组织相容性更好，可作为生物支架为细胞转移、增殖、分化提供所需的生长微环境[29]。

3 人羊膜在肌腱损伤修复中的应用

3.1 预防肌腱粘连，促进肌腱愈合 肌腱损伤后外源性修复系统启动，炎性细胞浸润，炎性介质释放，刺激成纤维细胞过度增生，大量胶原蛋白沉积，进而造成肌腱粘连[30-31]。建立物理屏障，阻断外源性修复，是预防肌腱粘连的可行途径。Liu等[31]将人羊膜与人工材料制成多层纳米纤维膜，并将其用于预防兔指深屈肌腱缝合修复后的肌腱粘连，结果显示生物复合羊膜材料可有效隔离外源性修复，增强内源性修复，从而预防肌腱粘连，促进肌腱愈合。Nicodemo等[32]研究了人羊膜在大鼠急性跟腱损伤修复中的作用，结果显示羊膜能降低炎性反应，增加成纤维细胞增殖，改善胶原纤维排列，从而预防腱周粘连，加速跟腱损伤修复。Sang等[24]对脱细胞羊膜预防肌腱粘连的作用进行了动物实验研究，结果显示脱细胞羊膜通过释放转化生长因子和成纤维细胞生长因子促进内源性修复系统并阻断外源性修复系统，从而预防肌腱粘连，加速肌腱愈合的作用。临床研究方面，一项多中心随机对照研究显示，屈肌腱缝合修复后应用人羊膜包裹屈肌腱较对照组可有效增加指间关节的活动范围，提高关节功能评分[33]。Ang等[34]将人羊膜覆盖肌腱损伤修复部位预防术后肌腱粘连，随访效果良好。但Leppänen等[12]报道5例应用羊膜包裹指屈肌腱缝合部位的病例，随访中1例患者发生肌腱再断裂，给予二次修复手术。1例患者出现指间关节黏连僵硬，其余3例患者随访结果一般。笔者认为该研究病例数少，且术中所用羊膜已冻存1年，这可能影响羊膜的效能和术后疗效。此外，虽然动物实验显示人羊膜包裹肌腱可起到预防肌腱粘连、促进肌腱愈合的双重作用。但临床研究显示人羊膜包裹肌腱的主要临床意义在于预防肌腱粘连，可能有一定的促进肌腱愈合的作用。

除人羊膜包裹肌腱可预防肌腱粘连、促进肌腱愈合外，还有研究显示颗粒状或粉末状人羊膜及人羊膜提取成分也可促进肌腱损伤修复。体外研究显示胎盘来源的含有颗粒状羊膜和羊水细胞的异体悬液移植物可显著增加腱细胞的密度并促进其迁移，增加胞外基质的沉积，下调炎性因子IL-8和转化生长因子TGF-β1蛋白表达，抑制炎症反应，从而促进肌腱损伤修复[35]。Ragni等[36]研究显示人羊膜间充质干细胞可分泌多种细胞因子和趋化因子促进胞外基质重塑，同时分泌多种胞外囊泡微小RNA促进巨噬细胞极化，抑制炎性反应，从而保护肌腱，促进肌腱损伤修复。Li等[37]研究显示人羊膜间充质干细胞可分化成前交叉韧带样细胞，与前交叉韧带细胞共培养后可明显增加前交叉韧带细胞的增殖和分化，促进前交叉韧带损伤修复。体内研究方面，Barboni等[38]对人羊膜上皮细胞修复羊跟腱损伤进行了研究，结果显示羊膜上皮细胞通过分泌调节因子抑制炎性细胞浸润，加速血管形成和胞外基质重塑，同时羊膜上皮细胞可原位分化为肌腱样细胞，从而促进肌腱损伤修复。De Girolamo等[39]应用人羊膜悬液异体移植修复鼠跟腱的腱病，术后14 d肌腱纤维排列明显改善，术后28 d肌腱损伤恢复正常。临床研究方面，一项纳入40例肌腱损伤病例的临床研究显示，羊膜和(或)绒毛膜粉末注射治疗后3个月91%的患者疼痛明显减轻，功能明显改善，临床疗效良好[40]。

3.2 促进腱骨愈合 腱骨界面由4 层结构组成，由外到内依次为肌腱(韧带)、未钙化纤维软骨、钙化纤维软骨和骨[41]。其中，纤维软骨负责传导机械载荷，是腱骨界面损伤的主要部位。由于纤维软骨无血运、再生能力差，损伤后腱骨愈合困难。如何促进腱骨愈合成为再生医学关注的焦点问题。Smith等[42]比较了羊膜基质支架、脱细胞真皮移植物和牛胶原支架对部分肩袖撕裂的修复作用，结果显示3 种移植物的肩袖修复效果均较对照组更好，羊膜基质支架、脱细胞真皮移植物优于牛胶原支架。邹刚等[43]研究显示Scleraxis基因转染人羊膜间充质干细胞可显著上调韧带分化相关基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白、细胞连接素C的mRNA表达水平，从而促进兔跟腱与骨隧道的腱骨愈合。Zhang等[44]研究了脱细胞羊膜复合FGF-2诱导的羊膜间充质干细胞对兔腱骨愈合的作用，结果显示术后3个月试验组均较对照组的骨形成量更大，骨隧道直径、腱骨间隙更小，腱骨交界区有大量纤维软骨形成，腱骨以直接连接形式愈合，腱骨愈合质量更好。

4 结语与展望

人羊膜在肌腱损伤修复中的作用已在动物体外和体内实验研究中得到体现，但相关临床研究相对较少，仍需要高质量的多中心随机对照研究证实。此外，现有研究主要为人羊膜对跟腱、屈肌腱、前交叉韧带等肌腱损伤缝合术后肌腱愈合的影响，鲜有人羊膜在肩袖损伤修复方面的报道。肩袖损伤术后再撕裂率可高达13% ～ 94%，应用新材料、新技术后肩袖再撕裂率仍高达20% ～60%[45]。肩袖术后腱骨愈合仍是亟待解决的重难点问题。鉴于人羊膜低免疫原性、富含生物活性物质、无临床应用伦理问题、来源充足等优势，可加强人羊膜在肩袖损伤修复方面的研究，以促进肩袖术后腱骨愈合，降低术后再撕裂率。同时，随着人羊膜相关研究的不断深入和生物技术的不断进步，人羊膜将可能成为临床上解决肌腱韧带修复和促进腱骨愈合的理想生物材料。