张明川，赵 刚，舒 畅，石 青

（重庆市铜梁区人民医院：1.呼吸内科；2.药剂科402560）

掌叶半夏蛋白对肺癌细胞增殖的影响研究*

张明川1，赵 刚2，舒 畅1，石 青1

（重庆市铜梁区人民医院：1.呼吸内科；2.药剂科402560）

目的观察掌叶半夏蛋白对肺癌细胞增殖的抑制作用。方法将体外培养的对数生长期的人肺癌细胞株A549随机分为空白对照组、掌叶半夏蛋白组（1.25、5.00、10.00 μg/mL）、阳性对照组（5.00 μg/mL顺铂）。利用四甲基偶氮唑蓝比色法测定各组细胞增殖相对抑制率；用流式细胞仪检测各组细胞周期；采用Western blotting测定B细胞淋巴瘤因子相关X蛋白（Bax）、B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）含量。结果作用24 h后，掌叶半夏蛋白组与阳性对照组吸光度（OD）值均显著低于空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），且掌叶半夏蛋白组呈剂量依赖性；与空白对照组比较，掌叶半夏蛋白组与阳性对照组在G0～G1期人肺癌细胞株A549细胞明显增多，而S期人肺癌细胞株A549细胞明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05），且掌叶半夏蛋白组呈剂量依赖性；掌叶半夏蛋白组与阳性对照组人肺癌细胞株A549细胞中Bax表达水平均显著高于空白对照组，而Bcl-2、Caspase-3表达水平及Bcl-2/ Bax显著低于空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），且掌叶半夏蛋白组呈剂量依赖性。结论掌叶半夏蛋白可调节人肺癌细胞株A549抗凋亡/促凋亡因子（Bcl-2/Bax）平衡，从而起到抑制细胞增殖的作用，且呈剂量依赖性。

肺肿瘤； 半夏； 植物蛋白质类； 细胞增殖； 细胞周期

目前，临床上对于早期肺癌患者常给予手术治疗，但是根治者不足30%，而放疗与化疗在杀死癌症细胞的同时会损伤正常细胞，不良反应大[1]。中医认为，肺癌的病因包括邪毒留滞、情志劳倦、饮食内伤等[2]，掌叶半夏，又名独角莲、独脚莲，味辛、性平，归肺、肝、脾经，具有燥湿化痰、散结消肿等功效。本研究通过观察掌叶半夏蛋白对肺癌细胞增殖的抑制作用，探讨其可能机制，为肺癌的治疗提供方案，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 注射用顺铂购自贵州汉方制药有限公司（批号：140913）；掌叶半夏蛋白为自制[3]。人肺癌细胞株A549购自中美合资博慧斯生物医药科技有限公司，DMEM培养基、胎牛血清、Trizol购于美国Sigma公司。

MinicylerTMPCT-150PCR反应仪购于美国MJ RE-SEARCH公司，HL-2920P酶标自动分析仪、蛋白质电泳和转移系统购于美国伯乐公司，Du-7HS型紫外分光光度计购自美国贝克曼公司。

1.2 方法

1.2.1 人肺癌细胞株A549培养 在37℃、5%CO2环境下，用含10%胎牛血清、100 μg/L链霉素及100 μg/L青霉素的DMEM培养基对人肺癌细胞株A549进行培养，高倍显微镜下观察细胞状态，当状态良好时（对数生长期）接种到培养板培养。

1.2.2 四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖相对抑制率 将对数生长期的人肺癌细胞株A549分为五组，Ⅰ组为空白对照组[不加药，加入同等体积二甲基亚砜（DMSO）]；Ⅱ～Ⅳ组为掌叶半夏蛋白组，分别加入不同浓度掌叶半夏提取物（1.25、5.00、10.0 μg/mL）；Ⅴ组作为阳性对照组（5.00 μg/mL顺铂），继续培养，分别于12、24、48 h后，加入1 mg/mL的MTT工作液，每孔500 μL，在570nm波长下检测吸光度（OD）值，分析测定掌叶半夏对人肺癌细胞株A549细胞增殖相对抑制率。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 将对数生长期的人肺癌细胞株A549分为五组，Ⅰ组为空白对照组（不加药，加入同等体积DMSO，Ⅱ～Ⅳ组分别加入不同浓度掌叶半夏提取物（1.25、5.00、10.0 μg/mL），V组作为阳性对照组（加入5.00 μg/mL顺铂），继续培养3 d后，磷酸盐缓冲液冲洗3次，加入50 μg/mL的碘化丙啶进行染色，每孔500 μL，用流式细胞仪检测，分析细胞周期。

1.2.4 Western blotting测定 Bax、Bcl-2、Caspase-3含量 在培养板中加入Trizol缓冲液1 mL裂解脂肪细胞5 min，然后4℃16 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水进行总RNA提取。使用RNA凝胶电泳检测RNA并进行定量。在42℃环境下加入Oligo和M-MLV反转录酶合成cDNA第1链。聚合酶链反应（PCR）扩增特异性cDNA。B细胞淋巴瘤因子相关X蛋白（Bax）cDNA序列上游引物（5′～3′）：CTTTGCCAGCAAACTGGTGC，下游引物（5′～3′）：GAGTCTCACCCAACCACCCT；B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bal-2）cDNA序列上游引物（5′～3′）：CCCTGTGGATGACTGAGTACC，下游引物（5′～3′）：GCCGTACAGTTCCACAAAGG。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）序列上游引物（5′-3′）：GTGAGGCGGTTGTAGAAGAGTT，下游引物（5′-3′）：TCACGGCCTGGGATTTCAAG。PCR扩增后以2%琼脂糖凝胶电泳，CFX-96数据采集系统拍照进行定量分析。用ECL显色（南京金斯瑞生物有限公司），β-actin作为对照。

1.3 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析或不配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 掌叶半夏蛋白对人肺癌细胞株A549增殖的抑制作用 作用24h后，掌叶半夏蛋白组与阳性对照组OD值均显著低于空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），并且掌叶半夏蛋白组呈现剂量依赖性：1.25 μg/mL掌叶半夏蛋白组的OD值高于阳性对照组，而10.00 μg/mL掌叶半夏蛋白组的OD值低于阳性对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），但5.00μg/mL掌叶半夏蛋白组OD值与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 掌叶半夏蛋白对人肺癌细胞株A549增殖的抑制作用[±s，lg（1/trans）]

表1 掌叶半夏蛋白对人肺癌细胞株A549增殖的抑制作用[±s，lg（1/trans）]

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与阳性对照组比较，bP＜0.05。

组别OD值12 h 24 h 48 h空白对照组掌叶半夏蛋白组1.25 μg/mL 5.00 μg/mL 10.00 μg/mL阳性对照组1.23±0.070.87±0.031.02±0.03 0.79±0.04ab0.53±0.04a0.36±0.02ab0.50±0.05a1.17±0.03 1.12±0.05 1.06±0.04 1.10±0.05 0.64±0.02ab0.42±0.06a0.18±0.03ab0.39±0.04a

2.2 掌叶半夏蛋白对人肺癌细胞株A549细胞周期的影响 与空白对照组比较，掌叶半夏蛋白组与阳性对照组在G0～G1期人肺癌细胞株A549细胞明显增多，S期人肺癌细胞株A549细胞明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05），但在G2～M期差异无统计学意义（P＞0.05）；掌叶半夏蛋白组呈现剂量依赖性：1.25 μg/mL掌叶半夏蛋白组人肺癌细胞株A549细胞在G0～G1期少于阳性对照组，在S期多于阳性对照组，而10.00 μg/mL掌叶半夏蛋白组人肺癌细胞在G0～G1期多于阳性对照组，在S期少于阳性对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），但5.00 μg/mL掌叶半夏蛋白组人肺癌细胞株A549细胞在G0～G1与S期与阳性对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 掌叶半夏蛋白对人肺癌细胞株A549细胞周期的影响[±s，lg（1/trans）]

表2 掌叶半夏蛋白对人肺癌细胞株A549细胞周期的影响[±s，lg（1/trans）]

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与阳性对照组比较，bP＜0.05。

组别G0～G1 G2～M S空白对照组掌叶半夏蛋白组1.25 μg/mL 5.00 μg/mL 10.00 μg/mL阳性对照组52.10±3.8216.20±1.9830.50±2.43 57.80±4.15ab62.50±4.47a69.80±4.29ab61.80±4.30a16.40±1.15 15.30±0.76 14.90±0.68 15.20±0.82 26.90±2.06ab24.30±1.45a20.90±1.02ab23.50±1.61a

2.3 掌叶半夏蛋白对人肺癌细胞株A549中Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的影响 掌叶半夏蛋白组与阳性对照组人肺癌细胞株A549细胞中Bax表达水平显著高于空白对照组，而Bcl-2、Caspase-3表达水平及Bcl-2/Bax均显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；掌叶半夏蛋白组呈剂量依赖性：1.25 μg/mL掌叶半夏蛋白组Bax表达水平低于阳性对照组，Bcl-2、Caspase-3表达水平及Bcl-2/Bax高于阳性对照组，而10.00 μg/mL掌叶半夏蛋白组Bax表达水平高于阳性对照组，Bcl-2、Caspase-3表达水平及Bcl-2/Bax低于阳性对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），但5.00 μg/mL半夏蛋白组上述指标与阳性对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 掌叶半夏蛋白对人肺癌细胞株A549中Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的影响[±s，lg（1/trans）]

表3 掌叶半夏蛋白对人肺癌细胞株A549中Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的影响[±s，lg（1/trans）]

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与阳性对照组比较，bP＜0.05。

组别Bax Bcl-2 Bcl-2/Bax Caspase-3空白对照组掌叶半夏蛋白组1.25 μg/mL 5.00 μg/mL 10.00 μg/mL阳性对照组162.00±10.90129.00±12.303.65±0.230.80±0.11 181.00±13.70ab189.00±14.90a194.00±16.50ab191.00±15.20a123.00±9.84ab109.00±7.49a101.00±8.01ab108.00±7.25a2.48±0.19ab1.95±0.18a1.73±0.15ab1.86±0.20a0.68±0.09ab0.57±0.10a0.49±0.08ab0.56±0.11a

3 讨 论

肺癌是由多基因损伤变异、不良生活习惯、职业暴露（砷、镍、煤焦油等）、空气污染等多种因素导致的、发生于支气管黏膜上皮的肺原发性恶性肿瘤，流行病学调查显示，肺癌在我国人群中的发病率为48/10万～53/10万，2013年因肺癌死亡人数居恶性肿瘤首位[4]。对于肺癌患者西医主要采用手术切除病灶（早、中期肺癌）或放疗与化疗抑制癌细胞增殖转移达到治疗肺癌的目的。但有研究表明，手术、放疗和化疗等西医治疗方法在清除、缩小肿瘤细胞的同时，也会对机体免疫系统造成影响，患者常因免疫功能损害而中断治疗[5]。随着中医药事业的发展，中药由于疗效确切、不良反应小等优点被逐渐应用于临床疾病治疗。中医认为，肺癌归属于“咯血”、“肺岩”、“胸痛”等范畴，将中药用于肺癌治疗[6-7]，可以通过抑制肺癌细胞增殖、诱导分化凋亡及完善免疫功能、加速体力恢复2个方面发挥治疗效果。掌叶半夏为天南星科植物掌叶半夏Rhizoma Pinelliae Pedatiseatae的干燥块茎，大量研究证实，掌叶半夏提取物能够调控宫颈癌细胞株HPVE6基因、p53基因的表达，抑制细胞增殖，且具有抗肿瘤、免疫作用[8-10]，掌叶半夏属于在肺癌治疗中使用频率最高的化痰药范畴，但是临床上对于其在对肺癌细胞的作用鲜有报道。

本研究选取人肺癌细胞株A549作为研究对象，观察掌叶半夏蛋白对肺癌细胞增殖的抑制作用，发现掌叶半夏蛋白作用24 h后对人肺癌细胞株A549增殖的抑制作用最佳，能够显著抑制细胞增殖，且呈现剂量依赖性。此外，本研究发现掌叶半夏蛋白组与阳性对照组在G0～G1期人肺癌细胞株A549细胞明显增多，而S期人肺癌细胞株A549细胞明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05），提示掌叶半夏蛋白能够使细胞增殖速度减慢。有研究表明，Bcl-2基因家族、Her2/neu基因、MYC基因在肺癌发生中发挥重要作用，其中促凋亡的Bax与抗凋亡的Bcl-2是Bcl-2基因家族的重要成员，Bax/Bcl-2比值与癌症细胞凋亡密切相关，而Caspase-3被称为“死亡蛋白酶”，在凋亡信号传导途径中发挥重要作用。本研究中掌叶半夏蛋白组与阳性对照组人肺癌细胞株A549细胞中Bax表达量显著高于空白对照组，而Bcl-2、Caspase-3表达量及Bcl-2/Bax显著低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），且掌叶半夏蛋白组呈剂量依赖性，提示掌叶半夏通过调控Bax、Bcl-2、Caspase-3表达发挥抗肿瘤作用。但是，掌叶半夏中的凝集素蛋白及毒针晶具有毒性[11-12]，会对正常细胞造成损伤。本研究仅针对肿瘤细胞抑制作用进行分析，未对正常细胞损害进行探讨，临床上应进行深入研究以提高其使用价值。

综上所述，掌叶半夏蛋白通过调控Bax、Bcl-2、Caspase-3表达抑制肺癌细胞增殖，发挥抗肿瘤作用。

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Study on effect of Pinellia pedatisecta Schott protein on proliferation of lung cancer cells*

Zhang Mingchuan1，Zhao Gang2，Shu Chang1，Shi Qing1
（1.Department of Respiration；2.Department of Pharmacy，Tongliang District People′s Hospital of Chongqing 402560，China）

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of Pinellia pedatisecta Schott protein on the proliferation of lung cancer cells.MethodsCultured human lung cancer cell line A549 in vitro at logarithmic growth phase were randomly divided into the blank control group，Pinellia pedatisecta Schott protein groups（1.25，5.00，10.00 g/mL）and positive control group（cisplatin 5.00 g/mL）.The relative inhibition rate of cell proliferation in each group was measured by MTT colorimetric method；the cell cycle was detected by flow cytometry；the contents of Caspase-3，Bcl-2 and Bax were determined by Western blotting.ResultsThe optical density（OD）value after 24 h action in the Pinellia pedatisecta Schott protein group and positive control group was significantly lower than that in the blank control group，the difference was statistically significant（P＜0.05），moreover the Pinellia pedatisecta Schott protein group showed a dose-dependent manner;compared with the blank control group，human lung cancer cell line A549 cells at stage G0～G1in the Pinellia pedatisecta Schott protein group and positive control group were significantly increased，while which at the stage S were significantly decreased，the differences were statistically significant（P＜0.05），moreover the Pinellia pedatisecta Schott protein group showed a dose-dependent manner；the Bax expression level of human lung cancer cell line A549 cells in the Pinellia pedatisecta Schott protein group and positive control group was significantly higher than that in the blank control group，while Bcl-2 and Caspase-3expression levels and Bcl-2/Bax were significantly lower than those in the control group，the differences were statistically significant（P＜0.05），moreover the Pinellia pediatisecta Schott protein group showed a dosedependent manner.ConclusionPinellia pedatisecta Schott protein can regulate the anti-apoptosis/pro-apoptosis factors（Bcl-2/ Bax）balance of human lung cancer cell line A549，thus plays the effect for inhibiting the cellular proliferation，moreover with a dose-dependent manner.

Lung neoplasms； Pinellia ternate； Plant proteins； Cell proliferation； Cell cycle

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.24.007

：A

：1009-5519（2016）24-3760-03

2016-11-15）

重庆市铜梁区科委2014年医疗卫生类社会事业科技资助项目（201405）。

张明川（1977-），硕士研究生，副主任医师，主要从事肺癌早期诊断及慢性气道炎症性疾病的防治研究。