唐 恬赵 婷赵 晖陈振振△

（1.首都医科大学中医药学院，北京 100069；2.中医络病研究北京市重点实验室，北京100069）

·实验报告·

附子及其炮制品对大鼠心脏毒性的影响*

唐 恬1，2赵 婷1，2赵 晖1，2陈振振1，2△

（1.首都医科大学中医药学院，北京 100069；2.中医络病研究北京市重点实验室，北京100069）

目的基于心电图变化和血清生化指标的改变，探讨附子及炮制品对大鼠心脏毒性的影响。方法 根据附子不同炮制品和给药剂量对雄性SD大鼠分组大鼠，按体质量随机分为10组，即空白组，生附子低、中、高3个剂量组，白附片低、中、高3个剂量组，黑顺片低、中、高3个剂量组，每组各10只。十二指肠注射给药，对比给药前后大鼠Ⅱ导联心电图（ECG）的变化，并检测大鼠血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）和B-型脑钠肽（BNP）水平。结果附子及其炮制品给药后，可短时间内显著增加心率HR、抬高S-T段、延长P-R间期（P＜0.05或P＜0.01），对QRS波群、Q-T间期的影响无统计学意义（P＞0.05）。生附子中剂量组和白附片中剂量组可显著提高CK和LDH水平（P＜0.05），附子及炮制品对BNP影响无统计学差异（P＞0.05）。结论生附子可引起ECG异常变化，导致不同程度的心肌损伤，并呈现一定的“量-毒”关系，炮制品黑顺片、白附片导致的心电异常较生附子减弱，有助于阐明炮制减毒的科学内涵。

附子 心电图 心脏毒性 “量-毒”关系

附子被誉为“回阳救逆第一品”，功能回阳救逆，助阳补火，散寒止痛，具有强心、扩张血管、抗心律失常、抗心肌缺血等作用［1］。历代医家将其作为亡阳虚脱证的首选药物，与此同时，应用附子后的临床不良反应报道也与日俱增，主要表现在对心脏和神经的损害，且发病急，病情重，对心脏的直接损害作用显著，引起心律失常，更有严重者发展为室颤危及生命［2］。附子不同组分及其炮制品在药效剂量范围内即可引起动物心电图、心肌酶谱的改变［3-5］，此外附子大剂量临床应用频率较大，中医“火神派”更是重用附子，动辄上百克［6］，临床应用与《中国药典》规定剂量相差甚远，但业者认为乌头类中药用量过大，可能导致临床不良反应发生。为此，本研究基于大剂量和常规剂量，重点考察附子及其炮制品对大鼠心脏毒性的影响，拟为阐释中药炮制减毒存效的科学内涵提供依据，也为指导临床合理用药提供参考。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验药材 生附子（批号：20160418）购于安国彤济中药材有限公司，黑顺片（批号：20160412）、白附片（批号：20160406）购于北京广惠康平价大药房，经首都医科大学中医药学院李佳副教授鉴定为毛莨科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根加工品，按2015年版《中国药典》附子项下检查，符合各项规定。

1.2 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠，体质量（250±20）g，共100只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001。取雄性SD大鼠，按体质量随机分为10组，即空白组，生附子低、中、高3个剂量组，白附片低、中、高3个剂量组，黑顺片低、中、高3个剂量组，每组各10只。

1.3 仪器和试剂 AR1140型电子分析天平 ［奥豪斯国际贸易（上海）有限公司］，SP2006心电图解析系统（北京软隆科技有限责任公司），UV-6100S型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司），2-16PK型高速冷冻离心机（德国SIGMA），单功能光吸收酶标仪［VersaMax美谷分子仪器（上海）有限公司］。BNP试剂盒 （批号：20160504），CK试剂盒 （批号：20160505），LDH试剂盒（批号：20160506），均购自南京建成生物工程研究所。

1.4 给药剂量设计 参照2015版《中国药典》［7］附子常用剂量3～15 g，按体表面积法折算大鼠对应等效给药剂量为0.27、1.35、5.4 g/kg（相当于临床成人用等效剂量3、15、60 g/d），按0.3 mL/100 g十二指肠注射给药，药液浓度分别为0.09 g/mL、0.45 g/mL、1.8 g/mL，标记为低、中、高剂量组。

1.5 药物制备 称取取生附子药材30 g，加入10倍量水，浸泡30 min，回流提取1 h滤过；再加入10倍量水，回流提取1 h滤过；合并2次滤液，经2100 r/min离心10 min，取上清液浓缩到13.9 mL，即得1.8 g/mL（高剂量组）；取0.5 mL高剂量组加水稀释到10 mL，即得0.09 g/mL（低剂量组）；取2.5 mL高剂量组加水稀释到10 ml，即得0.45 g/mL（中剂量组）。白附片、黑顺片同上述方法制备。

1.6 实验方法 参照文献［8］制定实验验方法。取各组大鼠称重标记，按0.35 mL/100 g剂量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，并仰卧固定于实验台上，通过四肢电极连接到SP2006心电图解析系统，监测Ⅱ导联心电图10 min，舍弃心电图异常动物，按0.3 mL/100 g十二指肠注射给药，空白组给予等量0.9%氯化钠注射液，监测给药后大鼠心电图120 min。停止采集，腹主动脉取血，静置30 min，3000 r/min离心20 min，分离得到血清，于-80℃贮藏备用。按照试剂盒说明书操作方法，测定大鼠血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）和B型脑钠肽（BNP）的活力和含量。

1.7 统计学处理 应用SPSS Statistics 20.0软件分析。数据以（s）表示，进行组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 附子及其炮制品对HR的影响 见表1。与自身给药前比较，各组在给药后5~10 min内，除白附片高剂量组外，其余各组均出现心率加快（P<0.05）；白附片、黑顺片高剂量组与生附子高剂量组相比心率显著降低（P<0.05或P<0.01）；给药30 min后，除白附片低剂量和中剂量组，其余各组均恢复心率接近给药前正常心率，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 附子及其炮制品 对HR的影响（次/min，s）

表1 附子及其炮制品 对HR的影响（次/min，s）

与自身给药前比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与生附子同时间同剂量组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别 剂量n给药前给药后0~5 min 5~10 min 10~30 min 30~60 min 60~90 min 90~120 min生附子 低 8 363.78±35.62 412.98±43.84*416.23±43.51**415.83±42.11*385.40±48.99 368.82±40.87 353.42±40.67中 8 367.69±15.66 408.75±37.82*416.91±37.95*389.41±31.29 373.28±33.55 372.16±35.74 358.17±26.30高 9 357.83±34.28 416.03±32.82**426.41±27.47**400.91±41.77*379.05±40.18 363.76±27.43 353.00±32.54白附片 低 10 376.23±30.32 412.24±27.66 423.58±31.79*419.74±24.15*425.74±26.27*△392.29±42.3 401.79±38.81△△中 9 343.70±35.22 410.29±45.80**430.76±28.50**394.77±62.92*395.55±52.92*408.53±24.95**△396.02±32.59**△高 10 362.38±16.94 385.63±48.48 380.24±43.38△401.18±36.76 399.97±30.93 367.53±44.78 385.30±29.81△黑顺片 低 10 372.89±44.58 410.40±49.94 426.08±41.43**422.92±34.23*404.08±42.89 366.71±39.70 370.55±24.75中 10 352.68±29.49 406.15±61.47**416.29±65.16**409.79±59.44**385.37±49.31 396.31±52.02*392.49±49.84*△高 10 360.67±24.12 398.19±35.71*412.04±36.37**△△401.03±27.26*384.64±17.41 375.07±31.17 357.16±36.55

2.2 附子及其炮制品对对S-T段的影响 见表2。结果为与自身给药前比较，各组均出现大鼠心电图S-T段升高的趋势，其中生附子中剂量组在给药5～120 min较给药前差异有统计学意义（P<0.05），高剂量组在给药后5～10 min和90～120 min较给药前差异有统计学意义（P<0.01）；白附片低、高剂量组在给药后90～120 min较给药前差异有统计学意义（P<0.01）；黑顺片中剂量组在给药后30～60 min较给药前差异有统计学意义（P<0.05）。90～120 min黑顺片高剂量组与生附子高剂量组相比S-T段显著降低（P＜0.05）。

表2 附子及其炮制品对S-T段的影响（1/100 mV，s）

表2 附子及其炮制品对S-T段的影响（1/100 mV，s）

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2.3 附子及其炮制品对QRS波群的影响 见表3。与给药前自身比较，各组均有延长QRS波群趋势，但无统计学意义（P＞0.05）。生附子和白附片给药组呈现一定量效关系。

表3 附子及其炮制品对QRS波群的影响（ms，s）

表3 附子及其炮制品对QRS波群的影响（ms，s）

组别 剂量n给药前给药后0~5 min 5~10 min 10~30 min 30~60 min 60~90 min 90~120 min生附子 低 8 17.79±2.39 18.16±2.23 19.26±3.26 19.18±2.26 20.21±2.75 21.15±3.39 22.86±4.21中 8 19.40±3.53 18.72±2.75 19.33±2.73 19.39±2.83 20.70±2.32 22.84±4.57 23.56±4.65高 9 19.90±1.61 20.97±2.02 21.64±1.81 23.00±2.29 23.68±2.15 25.04±3.27 25.75±2.84白附片 低 10 19.37±3.12 20.15±3.98 19.61±2.48 20.20±2.47 20.10±2.52 20.23±2.05 21.24±2.38中 9 20.12±3.00 21.08±3.08 21.15±3.09 21.98±2.95 22.85±2.88 23.07±2.77 22.82±2.40高 10 20.34±2.94 20.97±3.64 20.50±2.87 21.26±1.87 22.12±3.02 24.76±3.93 24.15±4.13黑顺片 低 10 18.68±4.30 19.36±3.32 19.56±3.10 20.30±3.45 21.82±4.18 23.85±3.11 23.92±3.31中 10 17.04±1.87 17.97±1.84 19.68±2.96 20.88±3.67 21.48±3.02 20.87±3.35 22.79±3.15高 10 18.16±3.28 17.83±2.89 18.46±3.05 19.32±2.82 20.22±3.23 19.78±3.17 20.30±3.78

2.4 附子及其炮制品对P-R间期的影响 见表4。与给药前自身比较，各组均有延长P-R间期的趋势，其中生附子低、中剂量组分别在10～120 min内出现显著差异（P＜0.05），高剂量组在60~120 min具显著差异（P＜0.05），并呈现量效关系；白附片中剂量和黑顺片低、中、高剂量在在60~120 min具显著差异 （P＜0.05）。白附片低、高剂量在60~120 min和黑顺片高剂量在60～90 min与生附子同时间同剂量组相比P-R间期缩短具显著差异（P＜0.05）。

表4 附子及其炮制品对P-R波群的影响（ms，s）

表4 附子及其炮制品对P-R波群的影响（ms，s）

给药后0~5 min 5~10 min 10~30 min 30~60 min 60~90 min 90~120 min生附子 低 8 50.28±3.79 50.28±3.79 53.19±7.00 52.84±6.31*57.33±7.14*64.08±9.95**65.84±12.47**中 8 52.40±3.32 52.40±3.32 53.05±3.25 55.89±3.05*59.52±4.23**61.40±10.15**56.46±12.26高 9 54.08±1.71 54.08±1.71 53.76±1.63 58.23±3.41 60.86±5.39 65.82±6.63*67.50±5.40**组别 剂量 n 给药前白附片 低 10 56.80±3.20 56.80±3.20 56.88±5.25 53.28±3.88 58.49±4.39 60.28±7.64 57.77±7.76△中 9 53.10±3.21 53.10±3.21 53.97±2.81 55.49±5.98*58.44±4.35**59.81±5.07**63.12±5.75**高 10 52.24±5.67 52.24±5.67 53.18±6.13 54.06±3.83△55.78±2.49 62.72±13.23 58.01±5.24△△黑顺片 低 10 51.06±3.29 51.06±3.29 53.56±2.97 57.55±3.27*57.04±8.43**63.40±7.52**60.30±2.06**中 10 52.86±3.00 52.86±3.00 53.21±4.88 55.31±3.71**54.71±8.09*55.75±9.32 56.18±8.54*高 10 53.21±2.79 53.21±2.79 51.41±4.57 56.84±5.53 56.65±4.45*58.43±4.59*△61.16±4.90**

2.5 附子及其炮制品对Q-T间期的影响 见表5。与给药前自身比较，各组均有延 长QT间期的趋势，但均无统计学差异（P＞0.05）。

2.6 附子及其炮制品对大鼠血清酶学指标的影响见表6。与空白对照组比较，生附子中剂量和黑顺片高剂量提高CK活力具有显著性差异（P＜0.05）。白附片中剂量能显著增加LDH活性（P＜0.05）。各组对脑钠肽（BNP）水平影响无统计学差异（P＞0.05）。

3 讨 论

SP2006心电解析系统集心电记录和心电分析于一体，可以采集并自动解析大小鼠、犬、猴等动物的心电图，也可以从生理记录机、心电图机、数据记录机等多种输出通道接收心电图。通过对大鼠心电的监测，我们可以分析药物的心脏毒性所引起的心电改变，利用该系统对衡量药物的毒性大小和不同药物的毒性对比具有很好的实际意义［9］。

本实验研究显示，附子及其炮制品可引起大鼠心电图出现心率HR加快、抬高S-T段、延长P-R间期、QRS波群、Q-T间期等不同程度的改变，尤其以1.35、5.4 g/kg剂量影响显著，并且以心率HR加快、抬高ST段、延长P-R间期为最主要的改变。S-T段的改变是反映心肌缺血性损伤程度的可靠指标，其升高或压低在诊断有无心肌缺血、心肌梗死、电解质紊乱中有重要意义。从结果看出，给药组均有使S-T段抬高的趋势，相比于生附子，炮制品使S-T段抬高的幅度更小，提示附子对大鼠造成一定心肌缺血损伤，具有一定心脏毒性，生品相比炮制品的影响更显著。

表5 附子及其炮制品对Q-T间期的影响（ms，s）

表5 附子及其炮制品对Q-T间期的影响（ms，s）

表6 对血清酶的影响（分，s）

表6 对血清酶的影响（分，s）

与空白组比较，*P＜0.05；与空白组比较，**P＜0.01。

组别 剂量 n CK（U/mL）空白组 - 6 3.97±1.66 11461.41±2592.85 76.54±29.87生附子 低 6 2.97±0.75 8952.58±2459.46 40.93±13.16 LDH（U/L） BNP（ng/L）中 6 5.46±0.72*14515.15±1681.43 68.89±14.64高 6 4.99±1.28 8230.35±1674.28 96.74±35.22白附片 低 6 4.61±0.89 13759.02±2026.09 120.83±42.10中 6 4.44±0.99 15763.46±4485.56*97.88±29.46高 6 3.55±1.54 10387.75±3412.86 98.46±46.46黑顺片 低 6 4.34±1.09 11222.32±4652.49 89.28±40.23中 6 4.48±1.42 15305.42±5764.40 114.72±52.02高 6 5.81±0.92*10900.43±1615.30**98.12±54.67**

P-R间期反映的是房室传导时间，异常延长时预示着房室传导阻滞的发生。从实验结果看出，给药组出现延长大鼠心电图P-R间期的变化，并随着时间的增加作用更显著，从10 min开始，炮制品各组与生品同等剂量组相比，P-R间期延长的时间均低于生品，房室传导阻滞较轻，提示我们附子炮制具有减毒作用。

QRS波群是心室除极时产生的心电波，宽度代表整个心室除极所花的时间。宽QRS波群可能是室性异位激动产生的心室除极所导致，而窄QRS波群可能是室上性异位激动产生的心室除极所导致。从结果来看，给药组均有延长大鼠ECG的QRS波群的变化，可能导致大鼠的心律失常，从心电图监测中发现，生附子给药组出现宽大畸形改变，这预示室早发生，但不具有统计学差异。

Q-T间期异常延长可导致室性心律失常的发生。在诊断某些心律失常、判断心肌梗死患者预后等方面有着重要的临床意义。结果显示，各给药组有延长大鼠心电图Q-T间期的趋势，并且随时间延长逐渐增加，生附子组的影响更加明显，提示生附子比炮制品更容易导致室性心律失常的发生。

附子及其炮制品在高于药效剂量15～60 g用药时，除发挥“回阳救逆”功效外，对大鼠的心脏也产生一定的毒副作用，表现为心率加快，出现房室传导阻滞，心肌缺血和梗死出现早期S-T段的显著抬高，提示我们临床中附子超常规剂量使用时，应注意ECG监测，避免对患者造成伤害。

心肌生化标志物的检测在诊断、监测、危险评估、预后和引导治疗都提供了方便的手段。乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、B-型脑钠肽（BNP）是几种缺血性心脏病经典的生化标记物，参与疾病发生、发展并与疗效观察有密切关系，可为临床评估心脏疾病危险性提供有价值的信息，提高临床诊断价值，并预示患者预后情况的变化［10-11］。实验结果显示，生附子及其炮制品在15、60 g等效剂量下，对大鼠心肌细胞产生一定的毒副作用，表现在CK、LDH活性升高，说明在药效剂量及以上应用附子时，可能引起心肌损伤的毒副作用，应结合早期血清毒性指标检测，调整用量，保证安全用药。附子毒性较大，主要毒性成分为乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等双酯型二萜类生物碱［12］。乌头碱可引起心肌细胞内钙离子浓度异常，导致钙离子稳态被破坏，是引起附子心脏毒性的主要机制，也有研究表明附子具有明显的抗胆碱和阻断迷走神经特性，从而诱导心律失常，间接通过心外神经介导造成心脏毒性［13-16］，但具体毒性机制有待进一步发现。

综上所述，生附子对于大鼠具有较强的心脏毒性，炮制品黑顺片和白附片对大鼠的心脏毒性较低，但高剂量的使用也会导致一定的毒性反应，包括心电图波段的血清生化指标的改变，提示我们早期检测相关指标对于指导附子临床应用有重要的意义。通过建立附子及其炮制品黑顺片和白附片的体外指纹图谱，结合药材和主要有效成分的毒性研究，建立附子“谱-毒”学关联性，将有助于阐明附子的毒副作用机制，是我们今后的研究方向。

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R285.5

A

1004-745X（2016）12-2286-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.023

2016-07-12）

北京市大学生毕业论文（设计）项目（0700-1160930302）

△通信作者（电子邮箱：chenzhenzhen1@126.com）