潘永梅陈志强

（1.河北中医学院基础医学院中医基础理论教研室，河北 石家庄 050200；2.河北省中医院，河北 石家庄 050011）

·研究报告·

活血化瘀中药汤剂对糖尿病肾病大鼠模型肾间质纤维化的影响*

潘永梅1陈志强2

（1.河北中医学院基础医学院中医基础理论教研室，河北 石家庄 050200；2.河北省中医院，河北 石家庄 050011）

目的观察活血化瘀中药汤剂对糖尿病肾病（DN）大鼠模型肾间质纤维化的影响，探讨其可能的作用机制。方法 选用健康雄性SD大鼠30只，采用高糖高脂饲料喂养、一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）诱导建立糖尿病SD大鼠模型，然后平分为DN模型组、活血化瘀组和厄贝沙坦组各10只，活血化瘀组选择活血化瘀中药汤剂灌胃服药，厄贝沙坦组选择厄贝沙坦溶液灌胃服药，模型组灌服等体积0.9%氯化钠注射液，记录三组肾间质纤维化相关指标的变化情况。结果所有大鼠都造模成功，活血化瘀组与厄贝沙坦组大鼠的肾质量都明显低于DN模型组（P<0.05）。实验后活血化瘀组与厄贝沙坦组组大鼠BUN、Scr较DN模型组明显降低（P<0.05）。实验后DN模型组、活血化瘀组和厄贝沙坦组大鼠尿白蛋白排泄率（UAER）值分别为（16.32± 4.29）mg/24 h、（11.50±2.59）mg/24 h和（12.20±3.01）mg/24 h，活血化瘀组和厄贝沙坦组较DN模型组明显降低（P<0.05）。TGF-β1主要在肾间质区、肾小管部位及小动脉中表达；FN主要表达在肾小球、细胞外基质和肾小管部位。Western蛋白印迹检测显示活血化瘀组和厄贝沙坦组的FN和TGF-β1蛋白表达水平明显低于DN模型组大鼠（P<0.05）。结论活血化瘀中药汤剂能够降低DN大鼠的肾脏肥大，提高肾功能，改善肾组织病变，通过抑制肾组织TGF-βl与FN的表达，延缓肾间质纤维化。

糖尿病肾病 活血化瘀中药汤剂 肾间质纤维化 动物实验 厄贝沙坦

糖尿病肾病（DN）是糖尿病主要的微血管并发症之一，其发生率随着糖尿病病程延长而逐年增高［1］。DN在早期无特异性临床症状，随着病程的发展，可出现肾小球滤过率降低、蛋白尿、水肿、高血压等症状，最终进入终末期肾病，是糖尿病患者主要的死亡原因之一［2-3］。DN的发病机制比较复杂，是多条途径与多种因素共同参与、相互作用的结果，其中肾间质纤维化是以肾小管发生萎缩和肌纤维母细胞的积聚为特征［4-5］。研究证明高血糖代谢紊乱主要通过多元醇通路代谢增强、糖基化终产物（AGEs）的产生、蛋白激酶C（PKC）途径激活3条途径损害肾脏，直接导致肾功能恶化［6-7］。目前研究表明TGF-β1参与调控细胞生长和细胞外基质的形成，在导致肾脏纤维化的病理变化过程中发挥了重要作用［8］；也可通过调节下游血管紧张素、细胞基质、炎性因子等因子而加速DN的进展［9］。现代中医临床已证实血瘀证的发生率随糖尿病病程的迁延而上升，已成为病程在10年以上病情控制不佳患者的普遍性证候，是DN发生的根源，是贯穿始终的病理变化。为此在治疗上需要活血化瘀，比如丹参、川芎、水蛭、地龙和全蝎等具有缓解血管痉挛、抗血小板解聚、扩张微血管、降低全血黏度等作用［10］。但由于各种原因，目前多数防治DN中药缺乏统一的量化指标，缺乏多中心、随机对照临床研究。本文通过动物实验探讨了活血化瘀中药汤剂对糖尿病肾病大鼠模型肾间质纤维化的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物与造模 选用健康雄性SD大鼠30只，4～5周龄，体质量140～160 g，河北医科大学动物中心提供，动物许可证号SCXK（冀）2013-1-003。饲养于清洁级动物实验室，相对湿度40%～60%，室温保持在18～25℃。12/12 h光照黑暗循环，自由获取食物和饮水。所有大鼠均给予高脂高糖饲料 （高脂高糖饲料配方：60%普通大鼠饲料、8%蛋黄粉、10%炼猪油、20%蔗糖、2%胆固醇）喂养8周。一次性腹腔注射链脲菌素（STZ，美国sigma公司）30 mg/kg，以连续3次非同日检测尾静脉血糖＞16.6 mmol/L者为DN模型大鼠建立成功。

1.2 分组及处理方法 选取DN模型大鼠30只，随机平分为DN模型组、活血化瘀组和厄贝沙坦组各10只。活血化瘀组予活血化瘀汤剂稀释后成按1.2 g/（kg·d）灌胃。厄贝沙坦组：给予厄贝沙坦蒸馏水稀释后12mg/（kg·d）灌胃；DN模型组：灌胃等量0.9%氯化钠注射液。所有大鼠均给予普通词料喂养，保持笼具卫生，进水不受限制，持续治疗6周，动物饲料由动物实验室统一采购。活血化瘀中药颗粒由广东一方制药有限公司惠赠。组成：丹参（批号402300T，1.8 g/袋，等同于饮片10 g），川芎（批号401235T，1.3 g/袋，等同于饮片6 g），地龙（批号402044T，1.0 g/袋，等同于饮片10 g），水蛭（批号408244T，1.5 g/袋，等同于饮片3 g），全蝎 （批号406498T，1.0 g/袋，等同于饮片3 g）。厄贝沙坦片（赛诺菲制药有限公司，批号2A368，0.15 g/片）。

1.3 观察指标 1）定期观察并记录实验大鼠活动。2）实验6周后所有大鼠置于独立的代谢笼中，自由饮水，留取24 h尿标本，采用Olympus AU2700全自动生化分析仪检测与计算尿白蛋白排泄率（UAER）。3）实验后用10%水合氯醛溶液对大鼠腹腔注射麻醉，采颈动脉血，室温静置约2 h，1500 r/min离心20 min，取上层血清，选择全自动生化分析仪检测血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）含量。4）肾脏标本采集。实验后处死大鼠后，分离双侧肾脏，在分析天平上称重；肾脏薄片，用4%中性甲醛固定液固定标本，用石蜡进行包埋，常规切片。5）Western蛋白印迹分析。取100 mg肾脏组织在液氮中研磨成粉，提取总蛋白，按照Western蛋白试剂盒说明书进行蛋白杂交分析，兔抗大鼠纤维连接蛋白（Fn）多克隆抗体与TGF-βl购自美国Abnova公司。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.00统计软件分析。计量资料以（s）表示，两两对比采用配对t检验；而计数数据采用百分比或者率表示，两两对比为χ2分析，多组之间的比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况观察 见表1。所有大鼠都造模成功，DN模型组：精神状态较差，行动迟缓，毛干枯、缺乏光泽，活动减少；活血化瘀组和厄贝沙坦组：精神状况较差，均出现了不同程度的多食、多尿、多饮。经过称重，活血化瘀组与厄贝沙坦组大鼠的肾质量都明显低于DN模型组（P<0.05）。提示DN大鼠出现早期肾脏肥大，而活血化瘀汤剂和厄贝沙坦具有改善DN大鼠肾脏肥大的作用。

表1 各组大鼠肾质量比较（mg，s）

表1 各组大鼠肾质量比较（mg，s）

与DN模型组比较，*P＜0.05。下同。

组别 n 肾质量DN模型组 10活血化瘀组 10 1345.22±163.35 1068.93±118.56*厄贝沙坦组 101111.43±165.11*

2.2 各组大鼠生化指标比较 见表2。经过检测，实验后活血化瘀组与厄贝沙坦组大鼠BUN、Scr均较DN模型组明显降低（P<0.05）。提示DN大鼠肾脏存在显著高灌状态，活血化瘀和厄贝沙坦能够改善DN高灌注状态。

表2 各组大鼠生化指标比较（s）

表2 各组大鼠生化指标比较（s）

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2.3 各组大鼠UAER水平比较 见表3。经过检测，实验后活血化瘀组和厄贝沙坦组UAER水平均较DN模型组明显降低（P<0.05）。提示DN大鼠常出现大量蛋白尿，中药活血化瘀可以延缓蛋白尿进展。

表3 各组大鼠UAER水平比较（mg/24 h，s）

表3 各组大鼠UAER水平比较（mg/24 h，s）

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2.4 各组大鼠肾组织纤维化指标比较 见表4。经过检测，TGF-β1主要在肾间质区、肾小管部位及小动脉中表达；FN主要表达在肾小球、细胞外基质和肾小管部位。Western蛋白印迹检测显示活血化瘀组和厄贝沙坦组的FN和TGF-β1蛋白表达水平明显低于DN模型组大鼠（P<0.05）。DN大鼠可导致FN和TGF-β1表达升高，而中药活血化瘀能抑制FN和TGF-β1的表达。

表4 各组大鼠肾组织纤维化指标比较（%，s）

表4 各组大鼠肾组织纤维化指标比较（%，s）

组别 n TGF-β1 FN DN模型组 10活血化瘀组 10 7.35±0.98 6.39±1.10 1.92±0.34*2.19±0.44*厄贝沙坦组 101.89±0.45*2.61±0.41*

3 讨 论

DN是糖尿病常见严重并发症之一，DN的发生将增加经济负担，是糖尿病患者的主要死因之一，也是糖尿病患者肾功能衰竭的主要原因［11］。DN发病机制复杂，其病变主要是逐渐的和不可逆转的肾小球硬化、肾间质纤维化，最终导致肾功能衰竭［12］。

DN肾间质纤维化特征性病理改变为系膜扩张、肾小球基底膜增厚、早期肾小球系膜细胞（GMCs）增殖、系膜外基质（ECM）过度积聚，最终导致肾功能衰竭［13］。当前研究表明高血糖、高血脂等多种代谢紊乱刺激GMCs增殖和基质蛋白代谢失衡，导致ECM沉积，引起并加重DN病变进展［14］。在药物治疗中，厄贝沙坦为血管紧张素Ⅲ型受体（ATl）拮抗剂（ARB），其可在受体水平完全阻断AngⅡ的作用，并可通过升高血浆AngⅡ水平，阻止尿微量蛋白的排出增加［15］。在活血化瘀中药汤剂中，丹参活血祛瘀，可消散瘀滞之血，具有“止血不留瘀”的优势。现代药理研究表明，丹参能降血脂、抑制血栓形成，还能抗血小板凝聚及调节内外凝血系统的功能。川芎活血行气，为血中之气药。与丹参配伍，相须为用，加强其活血之力。水蛭入血分，《本经》云其“主逐恶血、瘀血，破血瘕积聚”。现代研究表明，水蛭能阻止凝血酶对纤维蛋白原的作用，阻碍血液凝固；还能活化纤溶系统，促进已形成血栓溶解。全蝎性善通窜，能攻毒散结，通络止痛。现代药理研究表明其具有抗凝、抗血栓形成、促纤溶等作用。地龙长于通行经络，具有溶栓和抗凝作用，可明显延长血小板血栓和纤维蛋白血栓形成时间。水蛭、全蝎、地龙皆为中药中的常用虫类通络药，性善走窜，三药合用，可剔邪通络。综观全方，活血化瘀通络，切中病机，组方科学、配伍严谨；诸药合用，则肾络瘀阻可消［16］。本研究肾组织形态学观察显示，DN大鼠肾小球体积增大，而在活血化瘀中药与厄贝沙坦治疗后，肾脏肥大的病理改变明显改善。

蛋白尿是DN最常见的临床表现，它既是肾脏疾病的结果，也是参与DN的致病因素。尿蛋白可直接损伤系膜细胞，促进系膜细胞和系膜基质增生，形成异常的蛋白质，使纤维细胞增生，从而导致肾间质纤维化的发生［17］。并且蛋白尿的形成是与肾脏血流动力学改变导致的系膜基质扩展、内皮细胞功能障碍、足细胞损伤和基底膜增厚等肾间质纤维化病理改变密切相关［18］。瘀浊阻滞是DN的主要病理产物，伴随着中西医结合治疗日新月异的发展，中药在治疗DN方面也具有其独特的价值。活血化瘀类中药如丹参、川芎、水蛭、地龙和全蝎等具有扩张微血管、缓解血管痉挛、抗血小板聚集、降低全血黏度等作用。相关研究表明丹参可调节细胞免疫功能，对机体非特异性免疫功能和特异性体液免疫功能具有调理作用；血塞通片提取物能够清除氧自由基，抑制过氧化物产生，对肾缺血再灌注损伤有预防和保护作用［19-20］。本研究也表明活血化瘀类中药能通过降低蛋白尿进而阻止DN的发展。同时本研究还表明活血化瘀中药能够改善肌酐清除率，具有肾脏保护作用。

肾间质纤维化是以ECM成分代谢失衡、ECM积聚，基底膜增厚为特征。ECM主要由纤维连接蛋白（Fn）、胶原蛋白、层粘连蛋白等组成。同时细胞因子在DN发病中的作用不容忽视，涉及到肾小球血流动力学改变、细胞增殖和细胞肥大等诸多方面［21］。TGF-β1是已知致肾间质纤维化和肾小球硬化作用最强的细胞因子，能抑制肾近曲小管上皮细胞、肾小球脏层上皮细胞和肾小球毛细血管内皮细胞的增殖和分化，促进基底膜增厚，促进肾小球硬化；也可通过干扰正常细胞周期，诱导产生周期素依赖蛋白激酶抑制剂，进而抑制其激活，导致肾纤维化［22］。有研究证实水蛭可减轻大鼠的肾纤维化，地龙和全蝎能够抑制AGEs诱导的人肾小球系膜细胞TGF-β1表达［23］。我们采用免疫组化法和免疫印迹法对SD大鼠肾组织FN和TGF-β1进行检测，结果发现DN模型大鼠肾组织FN和TGF-β1的表达明显增加，活血化瘀中药与厄贝沙坦治疗6周显著降低FN和TGF-β1的表达水平。当前也有研究表明川芎嗪可减少免疫复合物的沉积，减轻足细胞损伤，有助于减轻系膜增生导致的肾小球硬化，能很好地改善肾功能，抗肾脏纤维化［4］。

总之，活血化瘀中药汤剂能够改善DN大鼠的肾脏肥大，提高肾功能，改善肾组织病变，通过抑制肾组织TGF-βl与Fn的表达，延缓肾间质纤维化。

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Effects of Huoxue Huayu Decoction on Kidney Interstitial Fibrosis in Diabetic Nephropathy Rats'Model

PAN Yongmei，CHEN Zhiqiang. Department of Basic Theory of Traditional Chinese Medicine of Basic Medical College，Hebei University of Chinese Medicine，Hebei，Shijiazhuang 050200，China.

Objective：To observe the effects of Huoxue Huayu decoction on kidney interstitial fibrosis in diabetic nephropathy rats'model to explore its possible mechanism.Methods：From January 2015 to July 2015，30 clean grade healthy male Sprague Dawley rats were fed with high glucose and high fat diet and injected with streptozotocin（STZ）for inducing diabetic SD rats'model，and then were equally divided into DN model group，irbesartan group and Huoxue Huayu group with 10 rats in each group.The Huoxue Huayu group was given Huoxue Huayu decoction by intragastric administration，the irbesartan group was given irbesartan solution by intragastric administration，the DN model group was fed with normal saline of the same volume，and the changes on the renal interstitial fibrosis related indexes were recorded in the three groups.Results：All rats were successfully modeled.The rat kidney weight in the Huoxue Huayu group and irbesartan group were significantly lower than that of the DN model group（P<0.05）.After the experiment，the serum BUN and Scr level in the Huoxue Huayu group and irbesartan group were significantly lower than that of the DN model group（P<0.05）.After the experiment，the rats'UAER in the DN model group，Huoxue Huayu group and irbesartan group were（16.32±4.29）mg/ 24 h，（11.50±2.59）mg/24 h and（12.20±3.01）mg/24 h.The value of Huoxue Huayu group and irbesartan group showed significant difference with the DN model group（P<0.05）.The TGF-β1 was mainly expressed in the renal interstitial region，renal tubular part and small artery，and FN was mainly expressed in the glomerular，extracellular matrix and renal tubular parts.Western blot showed that the expression level of TGF-β1 and FN protein in Huoxue Huayu group and irbesartan group were significantly lower than that of DN rats in the model group（P<0.05）. Conclusion：The traditional Chinese medicine Huoxue Huayu decoction can reduce renal hypertrophy in the dia-betic nephropathy rats，improve renal tissue condition by inhibiting the expression of TGF-β1 and Fn in renal tissue so as to delay renal interstitial fibrosis.

Diabetic nephropathy；Huoxue Huayu decoction；Renal interstitial fibrosis；Animal experiment；Irbesartan

R285.5

A

1004-745X（2016）12-2216-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.003

2016-09-22）

国家自然科学基金项目（No.81373804）；河北中医学院博士基金课题项目（BSZ2014004）