同时测定保健食品中烟酸、烟酰胺、咖啡因、维生素B1和维生素B6检测方法

2017-01-09

食品安全导刊 2016年30期

李明刘向前张玉华丽江市食品药品检验所

在现有标准GB/T 5009.197-2003的基础上，优化一种合理、快速的基于高效液相色谱分离，能同时测定烟酸、烟酰胺、咖啡因、维生素B1和维生素B65种成份的方法。探讨流动相、色谱柱、检测波长、稳定性等对上述5种成份分离的影响。结果显示，该方法标准曲线线性非常好，R大于0.999 99，RSD为1.1%～1.5%，样品加标回收率为98.5%～103.2%。可用于烟酸、烟酰胺、咖啡因、维生素B1和维生素B65种成份的同时检测，本法具有灵敏度高、重现性好、快捷高效等特点。

食品；烟酸；烟酰胺；咖啡因；维生素B1；维生素B6；高效液相色谱法

现代生活中，烟酸、烟酰胺、咖啡因、维生素B1（盐酸硫胺素）和维生素B6（盐酸吡哆醇）已成为人们补充维生素类产品中必不可少的东西，它们具有协同作用，调节新陈代谢，维持皮肤和肌肉的健康，增进免疫系统和神经系统功能，促进细胞生长和分裂（包括促进红血球的产生，预防贫血发生）。随着人们保健意识不断提高，市场上含以上5种成份的品种繁多，如何控制好5种成份的含量已成为目前的关注点，含量过高或过低都对身体无好处，为更好地控制产品质量，有必要建立简单、快速、高效的检测方法，目前测定以上5种成份的标准是GB/T 5009.197-2003，此标准中流动相、色谱柱、检测波长等方面均存在一定的问题，导致样品的回收率偏低、出具的数据也不准确，无法满足目前的测定需求，笔者在实际操作中经反复实验，对此方法进行改进，实验结果较满意。

1 仪器与试剂

Agilent 1200液相色谱仪，配有二极管阵列检测器，美国；LabTech EV311旋转蒸发仪，北京莱伯科技有限公司；赛多利斯BT224S电子天平，德国。

甲醇、乙腈（HPLC级，Fisher scientific）、辛烷磺酸钠（B8）为色谱纯，磷酸为分析纯，烟酸对照品，烟酰胺对照品，咖啡因对照品，维生素B1对照品，维生素B6对照品。

实验室用水均为锐思捷（ELGA）超纯水系统制备的超纯水。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax-C18，3.5 μm，150 mm×4.6 mm；流速：1.0 mL/ min；柱温：35 ℃；进样量：10μL；检测波长：烟酸、烟酰胺、咖啡因、维生素B1260 nm，维生素B6280 nm；流动相：溶剂A，0.1%的B8水溶液+磷酸，500 mL+0.5 mL；溶剂B，乙腈；提取液：甲醇-水-磷酸（100 mL+400 mL+0.5 mL）。

双波长条件和梯度条件见表1、表2。

表1 双波长条件

表2 梯度条件

2.2 标准溶液的配置

2.2.1 标准贮备液的配制

标准储备液A：准确称量已扣除水分的烟酸、烟酰胺和咖啡因对照品16 mg于10 mL容量瓶中，加提取液稀释并定容至刻度。再精密量取1 mL于20 mL容量瓶中，用提取液稀释并定容至刻度。

标准储备液B：准确称量已扣除水分的维生素B610 mg于10 mL容量瓶中，加提取液稀释并定容至刻度。再精密量取1 mL于20 mL容量瓶中，用提取液稀释并定容至刻度。

标准储备液C：准确称量已扣除水分的维生素B623.2 mg于100 mL容量瓶中，用提取液定容，再精密量取1 mL于20 mL容量瓶中，用提取液稀释并定容至刻度。

2.2.2 标准曲线

精密量取上述标准贮备液A、B、C，1.0、2.0、4.0、6.0mL和8.0mL分别置20 mL的容量瓶中，用提取液稀释并定容至刻度，摇匀备用。

2.3 样品前处理

精密称取样品（千林B族维生素片）1.00 g于10 mL容量瓶中，加提取液定容，超声提取5 min后，取上清液经0.45 μm滤膜过滤后待进样。

3 结果与讨论

3.1 流动相的选择

GB/T 5009.197-2003采用两种离子对试剂（硫酸月桂酸酯钠和1-葵烷磺酸钠），分两次测定维生素B1和其余4种物质，两种试剂价格较贵，用量少，市场不易购得，且5种物质用两套流动相分两次完成测定，不够方便快捷[1]。

已有文献报道同时测定功能性食用品中B族维生素的方法，如特殊键合色谱柱[2]，缓冲盐体系在C+柱上测定[3]，离子色谱对试剂和C18柱，反向离子对色谱法同时测定维生素B1和B6等[4-6]。三聚氰胺测定中用到色谱级B8，各实验室易得。本方法选用疏水链长度与癸烷磺酸钠接近的B8作为离子对试剂，经优化条件，得到满意的结果，且色谱柱在试验前后未见性能下降迹象[1]。

与国家标准方法相比，B8离子对试剂便宜易得，流动相系统简单，一次分析即可完成测定，且单次分析时间大大缩短，国家标准方法需做两次，分别为20 min和55 min，本文方法只需单次15 min。

3.2 色谱柱的选择

通过用粒径5 μm的C18柱和3.5 μm的C18柱，按上述色谱条件分别试验，如图1所示，粒径为3.5 μm的C18柱分析结果更佳，因此选择用粒径3.5 μm的C18柱进行分析。

3.3 检测波长的选择

分别对5种测定成分进行紫外吸收光谱分析，根据定量时应尽可能选择最大波长进行测定的原则，本文方法选择盐酸硫胺素、咖啡因、烟酸、烟酰胺的波长为260 nm，盐酸吡哆醇的波长为280 nm。

3.4 线性范围和检出限

用国家标准方法对混合标准溶液系列和样品溶液，按照所述的色谱条件进行测定，如图3、5所示，以所得峰面积对质量浓度进行回归，得到烟酸、烟酰胺、咖啡因、维生素B1和维生素B65种成份的线性回归方程，见表2。结果表明，5种成份在0.58～32.4 μg/mL内，按国家标准方法得到的线性关系一般，相关系数R大于0.992，烟酸、烟酰胺、咖啡因、维生素B1和维生素B65种成份的检出限为0.01～0.15 μg/mL，定量限为0.030～0.451 μg/mL；按本文方法对混合标准溶液系列和样品溶液进行测定，如图4、6所示，得到的线性关系非常好，相关系数R大于0.999 99 ，烟酸、烟酰胺、咖啡因、维生素B1和维生素B65种成份的检出限为0.000 47～0.005 20 μg/mL，定量限为0.001 41～0.01 56 μg/mL。

3.5 回收率与精密度

在本文色谱分离条件下，对已经过预先处理的食品进行分析测定，实验结果见表3和表4。