李 枫， 姚 丽， 张喜红， 夏玉红， 程 劼， 娄雪玲， 姜秋慧

(郑州人民医院妇科， 河南 郑州 450000)

miRNA-22在卵巢癌组织的表达及其对卵巢癌细胞增殖、迁移与侵袭的影响

李 枫△， 姚 丽， 张喜红， 夏玉红， 程 劼， 娄雪玲， 姜秋慧

(郑州人民医院妇科， 河南 郑州 450000)

目的： 观察在不同卵巢组织中miRNA-22的表达，并研究上调miRNA-22表达对卵巢癌细胞株SKOV-3增殖、迁移与侵袭的影响。方法:实时荧光定量PCR(qPCR)检测不同卵巢组织样本miRNA-22的表达；随机将SKOV-3细胞分为正常对照组(control组)、空白载体组(miRNA-22-NC组)和转染miRNA-22-mimic组(miRNA-22-m组)，qPCR检测各组细胞miRNA-22的表达，CCK-8法检测细胞存活率，划痕实验与Transwell小室法分别检测细胞的迁移与侵袭能力，Western blot法检测VEGF和P53蛋白表达。结果:卵巢癌组织中miRNA-22的水平显著低于正常卵巢组织；与control组相比，miRNA-22-m组细胞miRNA-22的表达显著增加，细胞存活率显著降低，细胞迁移数和侵袭数下降，VEGF和P53的蛋白表达水平显著下降。结论:miRNA-22的低表达可能与卵巢癌的发生发展有关。过表达miRNA-22能够抑制卵巢癌细胞株的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与下调VEGF和P53的蛋白表达有关。

miRNA-22； 卵巢癌； 细胞增殖； 细胞迁移； 细胞侵袭

卵巢上皮性癌(简称卵巢癌)是女性最常见的妇科恶性肿瘤之一，死亡率极高，转移快，侵袭能力强，复发性高，晚期患者五年生存率不及30%[1]。由于早期卵巢癌发病时无明显症状，临床上缺乏特异性高且敏感的诊断方法，70%以上的患者确诊时已经到达晚期[2]。

在人类癌症中，miRNA的功能可根据靶基因的作用不同调控肿瘤发生发展，具有癌基因或抑癌基因的作用[3]。miRNA通过与靶基因的3’非翻译区结合，诱导mRNA降解，抑制蛋白质翻译[4]。miRNA-22在多种肿瘤中表达异常，研究表明，miRNA-22在胃癌、肺癌、结肠癌及乳腺癌组织中低表达，在白血病和前列腺癌中高表达。本实验拟分析卵巢癌组织中miRNA-22的水平，并通过研究过表达miRNA-22对卵巢癌浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV-3增殖、迁移及侵袭能力的影响，探讨miRNA-22的表达是否能为卵巢癌的临床治疗具有指导意义。

材 料 和 方 法

1 实验材料

人卵巢癌浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV-3购自中国科学院上海细胞所；胎牛血清购自Gibco；RPMI-1640培养基和脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen；miRNA-22-mimic购自上海吉玛制药技术有限公司；VEGF、P53和β-actin抗体购自Santa Cruz。

2 实验样本

组织样本来自郑州人民医院2010年8月～2015年8月的正常卵巢组织40例，卵巢癌旁组织42例，卵巢癌卵巢组织41例，病例平均年龄(40.43±2.57)岁。各组织样本均由本院病理学专家检查并确认，经本院伦理委员会同意。各样本提取后立刻置于-80℃液氮中保存。

3 实验方法

3.1 实时荧光定量PCR(qPCR)检测miRNA-22 mRNA表达水平 严格按照TRIzol试剂说明书要求，提取相应组织的总RNA，蛋白定量后逆转录合成cDNA，采用PCR仪进行扩增， miRNA-22引物购于ABI PRISM。扩增条件：93 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，73 ℃ 40 s，共34个循环;72 ℃8 min。实验结果在荧光定量操作系统中进行分析对比，采用2-ΔΔCt对目标基因miRNA-22的mRNA表达进行相对定量。

3.2 细胞培养、分组与转染 将SKOV-3细胞株置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育至细胞融合约80%左右，进行传代。将细胞随机分为3组：正常对照组(control组)、空白载体组(miRNA-22-NC组)和转染miRNA-22-mimic组(miRNA-22-m组)。取对数生长期的细胞，以5×105的密度接种于96孔培养板，37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育至约60%，用脂质体LipofectamineTM2000转染，操作按照LipofectamineTM2000说明书进行，37 ℃、5% CO2的培养箱培养6 h后，更换含血清的正常生长培养基，37 ℃、5% CO2继续培养24～72 h。

3.3 CCK-8法检测细胞存活率 收集处于对数生长期的各组细胞，调整为细胞悬液，按每孔2×105个，加入48孔板中，置于37 ℃、5% CO2培养箱孵育12 h、24 h、36 h和48 h后，分别取各阶段的细胞，加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育4 h，利用酶标仪测定于450 nm波长处的吸光度(A)，计算细胞存活率，存活率(%)=实验组A值/空白组A值×100%。

3.4 划痕实验 收集各组细胞，以2×108/L接种于48孔板中，待细胞融合到80%～90%，用枪头沿着与皿底垂直方向划痕，PBS洗涤细胞3次，加入无血清培养基，置于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后，观察细胞迁移轨迹，记录细胞影像数据，计数。

3.5 Transwell法检测细胞侵袭 Transwell小室的上室加入50 μL稀释的Matrigel，孵育1 h使凝固。细胞转染24 h后，吸尽培养液，更换无血清培养基培养24 h，胰酶消化，制成密度为2×108/L的细胞悬液。上室加入100 μL细胞悬液，下室加入500 μL 含1%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2孵箱中培养24 h，棉签擦除上室上面的非侵袭细胞，另一面用5 mL甲醇/醋酸(3∶1)固定20 min，0.5%结晶紫染色10 min，倒置于显微镜下观察小室面的细胞个数，实验重复3次。

3.6 免疫印迹法 细胞转染24 h后，收集各组细胞，用RIPA细胞裂解液裂解，提取总蛋白后定量，调整蛋白浓度。取适量裂解产物，上样后进行SDS-PAGE电泳，电转至硝酸纤维素膜，加入5%脱脂牛奶室温封闭1 h，孵育相应Ⅰ抗，4 ℃摇床过夜，室温孵育相应Ⅱ抗1 h， 化学发光法显色，成像扫描分析系统测定蛋白条带的积分吸光度。

4 统计学处理

实验结果以均数±标准差(mean±SD)表示，实验数据两组间均数比较时采用Bonferroni校正的t检验，所有数据均在SPSS 15.0统计软件中进行统计，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 正常卵巢组织、卵巢癌旁组织与卵巢癌卵巢组织miRNA-22的表达

实时荧光定量PCR检测结果显示，正常卵巢组织中miRNA-22的表达显著高于卵巢癌卵巢组织，差异具有统计学意义(P<0.05)，卵巢癌旁组织与正常卵巢组织miRNA-22的表达差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

Figure 1.The expression of miRNA-22 in normal ovarian tissues (40 cases), para-carcinoma tissues (42 cases) and ovarian cancer tissues (41 cases). Mean±SD.*P<0.05vsnormal ovarian tissue.

图1 各卵巢组织中miRNA-22的表达

2 转染miRNA-22-mimic后各组细胞miRNA-22的表达

转染miRNA-22-mimic后，miRNA-22-m组miRNA-22的表达显著上升(P<0.05)，miRNA-22-NC组miRNA-22的表达无显著变化(P>0.05)，提示miRNA-22转染成功，见图2。

Figure 2.The expression of miRNA-22 after transfection of miRNA-22-mimic. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol.

图2 转染miRNA-22-mimic后各组SKOV-3细胞miRNA-22的表达水平

3 过表达miRNA-22对SKOV-3细胞存活率的影响

CCK-8法检测结果显示，control组和miRNA-22-NC组的细胞存活率随时间推移迅速增长，与control组相比，miRNA-22-m组的细胞存活率随时间增长的幅度明显减少(P<0.05),见图3。

Figure 3.Survival rate of SKOV-3 cells after transfection of miRNA-22-mimic. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图3 转染miRNA-22-mimic后各组SKOV-3细胞存活率变化

4 过表达miRNA-22对SKOV-3细胞迁移能力的影响

划痕实验检测SKOV-3细胞的迁移能力，与control组相比，转染miRNA-22-mimic后，SKOV-3细胞的迁移速率显著减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，control组和miRNA-22-NC之间差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

5 过表达miRNA-22对SKOV-3细胞侵袭能力的影响

Transwell侵袭实验结果显示，与control组相比，转染miRNA-22-mimic后，SKOV-3细胞发生侵袭的细胞数显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，control组和miRNA-22-NC之间差异无统计学意义，见图5。

6 过表达miRNA-22对VEGF和P53蛋白表达的影响

Western blot法结果显示，与control组相比，转染miRNA-22-mimic后，VEGF和P53的蛋白表达水平显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)，control组和miRNA-22-NC之间差异无统计学意义,见图6。

讨 论

miRNA是长度约为22个碱基大小的非编码RNA，通过抑制靶基因的功能或降解靶基因，从而在转录后水平调节基因表达。研究表明miRNA参与多种复杂的生物过程，如胚胎发育、器官形成等。miRNA具有组织特异性，可以准确地界定分化肿瘤[5]。多项研究发现miRNA-22具有抑癌基因的作用效果，对多种肿瘤具有调控作用。我们研究结果显示，miRNA-22在卵巢癌卵巢组织中表达显著低于正常卵巢组织，表明miRNA-22在卵巢组织的低表达提示有卵巢癌的可能性。miRNA-22通过转录后修饰ErbB3，抑制肺癌细胞系A549和H1299的增殖和侵袭能力[6]。此外，报道指出miRNA-22通过阻止雌激素信号通路来抑制乳腺癌细胞的生长[3，7]，通过调控EVI-1癌基因的表达，从而抑制乳腺癌的转移[8]。miRNA-22通过抑制肝癌细胞的HDAC4基因，从而抑制HCC细胞系的增殖，通过抑制NF-κB的表达从而抑制肝癌生成[10]。我们研究结果显示，过表达miRNA-22后，SKOV-3细胞的存活率、迁移能力和侵袭能力降低，提示miRNA-22过表达具有抑制卵巢癌细胞的增殖，迁移和侵袭能力。

Figure 4. The number of migratory SKOV-3 cells after transfection of miRNA-22-mimic. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图4 转染miRNA-22-mimic后各组SKOV-3细胞迁移数变化

Figure 5. Invasive ability of SKOV-3 cells after transfection of miRNA-22-mimic. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图5 转染miRNA-22-mimic后各组SKOV-3细胞侵袭能力变化

Figure 6.Protein expression of VEGF and P53 after transfection of miRNA-22-mimic. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图6 转染miRNA-22-mimic后VEGF和P53蛋白表达变化

VEGF是高度特异的血管生长因子，能够增加血管通透性，刺激内皮细胞的分裂和增殖，进一步促进血管的形成[11]，另一方面增加血管通透性导致肿瘤患者形成腹水。国外学者研究发现[12]，测定血清中VEGF的含量水平有助于断定卵巢肿瘤的良性与恶性。国内报道指出卵巢上皮性癌组织中VEGF呈高表达，恶化速度快，在肿瘤发生后迅速进入晚期，生存率低[13]。P53基因野生型为抑癌基因，对细胞生长具有抑制作用，突变型具有致癌的活性，是肿瘤形成的原因之一。报道指出卵巢上皮性癌中P53突变型达到44%～62%[14-15]。我们研究结果显示，过表达miRNA-22后，SKOV-3细胞的VEGF和P53蛋白表达显著降低，提示过表达miRNA-22后，可能与VEGF和P53的3’端UTR结合，从而促进VEGF和P53的降解，从而抑制癌症细胞的生长、迁移和侵袭，从而具有抑制卵巢癌的作用。当然，进一步具体的详细机制还需进行下一步实验进行确定。

本研究表明，miRNA-22的表达对卵巢癌的诊断具有提示作用，在指导临床治疗方面具有重要意义。

[1] Sankaranarayanan R, Ferlay J. Worldwide burden of gynaecological cancer: the size of the problem[J]. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 2006, 20(2): 207-225.

[2] Liu CG, Calin GA, Meloon B, et al. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(26):9740-9744.

[3] Xiong J, Yu D, Wei N, et al. An estrogen receptor alpha suppressor, microRNA-22, is downregulated in estrogen receptor alpha-positive human breast cancer cell lines and clinical samples[J]. FEBS J, 2010, 277(7):1684-1694.

[4] Farazi TA, Spitzer JI, Morozov P, et al. miRNAs in human cancer[J]. J Pathol, 2011, 223(2):102-115.

[5] Lu J, Getz G, Miska EA, et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers[J]. Nature, 2005, 435(7043): 834-838.

[6] Ling B, Wang GX, Long G, et al. Tumor suppressor miR-22 suppresses lung cancer cell progression through post-transcriptional regulation of ErbB3[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2012, 138(8):1355-1361.

[7] Pandey DP, Picard D. miR-22 inhibits estrogen signaling by directly targeting the estrogen receptor alpha mRNA[J]. Mol Cell Biol, 2009, 29(13): 3783-3790.

[8] Patel JB, Appaiah HN, Burnett RM, et al. Control of EVI-1 oncogene expression in metastatic breast cancer cells through microRNA miR-22[J]. Oncogene, 2011, 30(11):1290-1301.

[9] Takata A, Otsuka M, Kojima K, et al. MicroRNA-22 and microRNA-140 suppress NF-κB activity by regulating the expression of NF-κB coactivators[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011, 411(4):826-831.

[10]殷建瑞, 张 波, 谭丽华, 等.丁苯酞对缺氧缺糖条件下血管内皮细胞VEGF和HIF-1α表达的影响[J].中国病理生理杂志, 2011, 27(4):643-647.

[11]Cooper BC, Ritchie JM, Broghammer CL, et al. Preope-rative serum vascular endothelial growth factor levels: significance in ovarian cancer[J]. Clin Cancer Res, 2002, 8(10):3193-3197.

[12]申桂华, 张 毅.卵巢上皮性癌中p53和VEGF表达的相互关系及其临床意义[J].中国肿瘤临床与康复，2006, 13(3)：209-211.

[13]Fallow S, Price J, Atkinson RJ, et al. p53 mutation does not affect prognosis in ovarian epithelial malignancies[J]. J Pathol, 2001, 194(1):68-75.

[14]陈 默, 殷啸俊, 尧良清, 等. 缺氧诱导上皮卵巢癌细胞分化逆转机制的实验研究[J].中国病理生理杂志,2011, 27(5)：848-852.

(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Expression of miRNA-22 in ovarian cancer and effect of miRNA-22 over-expression on SKOV-3 ovarian cancer cell proliferation, migration and invasion

LI Feng, YAO Li, ZHANG Xi-hong, XIA Yu-hong, CHENG Jie, LOU Xue-ling, JIANG Qiu-hui

(DepartmentofGynaecology,ZhengzhouPeople’sHospital,Zhengzhou450000,China.E-mail:lifeng198104@163.com)

AIM: To examine the expression of miRNA-22 in the ovarian tissues and the effect of miRNA-22 over-expression on the proliferation, migration and invasion in SKOV-3 cells. METHODS: The expression levels of miRNA-22 in different ovarian tissues and SKOV-3 cells were determined by qPCR. miRNA-22 was over-expressed by transfection of miRNA-22 mimic. The cell viability was examined by CCK-8 assay. The cell migration was measured by wound healing test. The cell invasion was analyzed by Transwell assay. The protein expression levels of VEGF and P53 were determined by Western blot. RESULTS: Compared with the normal ovarian tissue, the expression level of miRNA-22 was remarkably decreased in the ovarian tumor tissues. After transfection with miRNA-22 mimic, the expression level of miRNA-22 in the SKOV-3 cells was significantly increased, while the cell viability, migration and invasion were obviously decreased. Moreover, the protein expression of VEGF and P53 was dramatically inhibited after over-expression of miRNA-22. CONCLUSION: The decreased miRNA-22 expression may be correlated with the development of ovarian can-cer. Over-expression of miRNA-22 decreases the cell viability, migration and invasion by reducing the protein expression of VEGF and P53.

miRNA-22; Ovarian cancer; Cell proliferation; Cell migration; Cell invasion

1000- 4718(2016)12- 2251- 05

2016- 05- 23

2016- 09- 26

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.021

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0371-67077037; E-mail: lifeng 198104@163.com