王 莹， 吕心瑞

(河南大学 1第一附属医院， 2医学院生理教研室， 河南 开封 475004)

Am80抑制血管内皮细胞增殖和血管新生内膜形成的机制研究*

王 莹1， 吕心瑞2△

(河南大学1第一附属医院，2医学院生理教研室， 河南 开封 475004)

目的： 探讨维甲酸衍生物Am80抑制血管内皮细胞增殖和大鼠颈总动脉内皮剥脱术后新生内膜增生的机制。方法:用不同浓度Am80处理EA-hy926细胞24 h后，应用细胞计数和MTS细胞活力分析检测细胞的增殖情况；将Am80处理的细胞进行PI染色，用流式细胞术检测细胞周期的变化情况；通过real-time PCR方法分析Am80处理后EA-hy926细胞中cyclinB1、P21和基质金属蛋白酶(MMP)-2表达的变化；制备SD大鼠颈总动脉内皮球囊损伤模型，通过HE和免疫组化染色方法，观察Am80对球囊损伤后新生内膜形成的影响。结果:细胞计数和MTS细胞活力分析结果显示，Am80以浓度依赖性方式抑制EA-hy926血管内皮细胞增殖；流式细胞分析显示，Am80可使EA-hy926细胞周期停滞在G2/S期；real-time PCR结果表明，Am80处理后，EA-hy926细胞中P21表达上调，cyclinB1和MMP-2表达水平降低；内皮损伤动物模型结果显示，Am80处理后新生内膜的形成受到显著抑制。结论:Am80可通过促进P21而抑制cyclinB1表达，从而抑制血管内皮细胞增殖和血管新生内膜的形成。

Am80; 血管内皮细胞； 内膜增生； 细胞周期

血管内膜损伤是动脉粥样硬化、血管术后再狭窄等心血管疾病的主要病理因素。血管内皮细胞异常增殖常常发生在血管损伤之后，内皮细胞增殖和迁移能力的增强，常常又是引起高血压等血管增殖性疾病的主要病理基础。所以抑制血管内膜异常增生是预防和扭转心血管疾病的根本措施之一。Am80是一种人工合成的维甲酸衍生物，是维甲酸受体α的激动剂，已经在临床上用于治疗急性早幼粒细胞性白血病[1]。新的研究证明，Am80也可以通过激活其它的分子通路，促进其抗增殖、促分化的生物功能[2-4]。在心血管组织中，Am80能诱导血管平滑肌细胞分化并抑制其增殖和迁移，有效抑制大鼠动脉粥样硬化模型中血管内膜的增生[5-7]。在前期研究中，我们已经揭示了Am80可以通过提高核转录因子Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4, KLF4)的表达水平，抑制血管平滑肌的迁移和异常增生[8]。但对于Am80如何抑制血管内皮细胞的增殖，通过什么通路抑制内皮细胞增殖的则知之甚少。本研究主要通过Am80对内皮细胞增殖及对大鼠颈总动脉球囊损伤模型中内膜增生的研究，揭示了Am80在抗细胞增殖和周期蛋白的调控上抑制血管内膜增殖的分子机制。

材 料 和 方 法

1 细胞株和试剂

兔抗cyclinB1和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-2多克隆抗体购自Abcam；Am80和Tween-80购自Sigma；碘化丙啶(propidium iodide，PI)购自Beckman；MTS试剂盒购自Promega；引物合成来自上海生工；羊抗兔II抗和DAB试剂盒购自北京中杉金桥；人脐静脉内皮细胞株EA-hy926购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

2 方法

2.1 细胞培养 细胞贴壁生长于细胞瓶中，用含10%胎牛血清及1×105U/L青、链霉素的DMEM培养液置于37 ℃、5% CO2、相对湿度90%的培养箱中培养，定期换液传代，取对数生长期细胞用于实验。

2.2 细胞计数 细胞接种于96孔板，每孔加入100 μL，细胞浓度为2×107/L，于37 ℃、5% CO2、相对湿度90%的培养箱中培养24 h，加入不同浓度的Am80培养24 h。取10 μL细胞悬液与0.2%台盼蓝溶液混合染色至计数板上计数。

2.3 MTS实验检测细胞活力 采用CellTiter 96® AQueous 单溶液细胞活力试剂盒(Promega)，按说明书流程操作，用细胞计数仪调整细胞浓度为为2×107/L，在 96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液，每组设6个复孔，培养一段时间后，每孔加入20 μL MTS试剂于培养箱培养2 h，终止反应，应用全自动多功能酶标仪检测其490 nm波长处的吸光度(A)值。

2.4 流式细胞术分析细胞周期 取对数生长期EA-hy926细胞接种于6孔板，培养24 h后，加入不同浓度Am80作用于细胞24 h，收集各孔细胞及上清，离心弃上清，用冷PBS洗2次，调整各孔细胞数量为1×106，加入预冷的70%乙醇固定细胞，4 ℃过夜。离心收集细胞，PBS洗过后，加入含50 mg/L PI、100 mg/L RNaseA、0.2% Triton X-100工作液500 μL，孵育15 min后用流式细胞仪检测。重复3次。

2.5 Real-time PCR实验 采用TRIzol总RNA提取试剂(Invitrogen)提取细胞总RNA，以Oligo(dT)18为引物，按照M-MLV反转录试剂盒说明书(Promega)操作进行反转录。得到的cDNA按SYBR Green PCR Master Mix试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR检测。 P21的上游引物序列为5’-CTTCATCTCTCGGTCCCTTC-3’，下游引物序列为5’-CGGGTTACTCCTTCTGTTGT-3’；cyclinB1的上游引物序列为5’-AGGGCTGCCACGGACCGAGT-3’，下游引物序列为5’-CTGGCACCGGGAGGGCACTT-3’；MMP-2的上游引物序列为5’-AGACCCCGGAGGCTAAGGAGTT-3’，下游引物序列为5’-TCCGTCATAGTGTCCTCCATCA-3’；GAPDH的上游引物序列为5’-CAGCCCAGAACATCATCCCT-3’，下游引物序列为5’-GCCTCTCTCTTGCTCTCAGTA-3’。每个PCR反应体系包括为2 μL稀释的RT产物、10 μL SYBR Green PCR Master Mix以及250 nmol/L上、下游引物，总反应体积为20 μL，经ABI 7500实时荧光定量PCR系统检测，反应循环参数为：95 ℃ 5 s、60 ℃ 35 s，共40个循环。基因的表达变化用2-ΔΔCt法计算，以GAPDH mRNA的水平作为内参照。

2.6 颈总动脉内皮损伤动物模型的复制 参照之前的手术方法[5]，实验动物用25%乌拉坦 (3 mL/kg) 腹腔注射麻醉，常规消毒，从颈外动脉远心端结扎，将颈内动脉和颈总动脉近心端用血管夹关闭血流，于颈外动脉远心端扎线部位的内侧剪一楔形切口，球囊导管自切口处向近心端插入，打开血管夹，导管穿过颈总动脉至主动脉分支处。注入约100 μL生理盐水充盈球囊，然后将球囊拖回到切口处，其间以导丝为轴线旋转球囊。如此反复3次，退出球囊，关闭切口，恢复血流。体重 250～300 g的雄性SD大鼠随机分为3组，分别为假手术(sham)组、损伤(injured)组、Am80组。Am80组大鼠于术前1 d至术后28 d进行1 mg·kg-1·d-1灌胃给药，其它组大鼠以同样方式给予相同剂量的Tween-80，实验期间给予普通饲料饮食，自由进食进水，于术后28 d从股动脉放血处死动物，迅速分离左侧颈总动脉和对侧血管用于后续实验。

2.7 血管HE染色观察 切片常规脱蜡至水，苏木精染色5 min；自来水冲洗返蓝5 min，1% 盐酸乙醇稍分化数秒，自来水冲洗5 min；伊红染色10 s；常规梯度乙醇脱水，即依次放入70%、80%、90%、95%的乙醇3 s 和无水乙醇中3 min、3次，二甲苯透明3 min、3次；中性树胶封片；镜下观察、照相，进行图像学分析。

2.8 血管免疫组化观察 切片常规脱蜡至水，抗原修复后，滴加3% H2O2去离子水，室温孵育10 min；消除内源性过氧化物酶影响，滴加正常山羊血清工作液，室温孵育15 min进行封闭；倾去血清，滴加兔抗cyclinB1多克隆抗体(1∶100)；片子平放保湿盒中4 ℃过夜后，滴加生物素化 II 抗工作液，室温孵育15 min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15 min；滴加DAB试剂显色，显微镜下控制显色时间，自来水冲洗终止反应；苏木精复染细胞核；常规脱水、透明、封片；镜下观察、照相，进行图像学分析。

2.9 血管组织总蛋白的提取 分离大鼠颈总动脉，于冷PBS中洗净血液，去除血管外结缔组织，将血管剪碎后置匀浆套管中，100 mg 组织加入1 mL RIPA裂解液，冰浴匀浆。匀浆后静置30 min。4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清 (即蛋白提取液)，分装储存于-80 ℃备用。 以牛血清白蛋白为标准品，用改 良的Lowry 法进行蛋白定量。

2.10 Western blot分析 灌制 8%分离胶和5%浓缩胶。用微量加样器将样品加入到凝胶加样孔内。 90 V稳压电泳约30 min，待溴酚蓝进入分离胶后，换用120 V 稳压电泳，至溴酚蓝前缘移动到距凝胶底部0.5 mm，停止电泳，取出凝胶，进行半干转膜，然后取出PVDF膜，置于含5%脱脂奶粉的封闭液中，室温封闭 2 h。 将封闭后的PVDF膜置入用TBST以适当比例稀释的I抗溶液中，4 ℃缓慢摇动过夜。室温洗膜，然后将PVDF膜置入用TBST 1∶20 000稀释RDye～800CW 荧光标记II抗溶液中，于室温反应1 h, 室温洗膜后用Odyssey发光。

3 统计学处理

应用SPSS 16.0统计软件进行处理，所有数据以均数±标准差(mean±SD)表示。均数先进行单因素方差分析，然后用Bonferroni校正的t检验行各组均数间两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Am80抑制血管内皮细胞增殖

细胞计数实验显示，Am80不同浓度刺激EA-hy926细胞24 h后，细胞数量随浓度增加逐渐减少；而且MTT分析结果也显示，Am80刺激EA-hy926细胞后，细胞活力随浓度逐渐下降，这一结果与细胞周期数据分析具有一致性，见图1。

Figure 1.Am80 inhibited the proliferation of EA-hy926 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

图1 Am80 抑制血管内皮细胞的增殖

2 Am80阻滞血管内皮细胞周期进程和抑制周期蛋白的表达

用不同浓度的Am80刺激血管内皮细胞24 h后发现，Am80可使内皮细胞周期停滞在G2/S期(P<0.05)，说明Am80可诱导细胞周期阻滞。为了探讨 Am80 诱导细胞周期阻滞的作用机制，我们选用不同浓度Am80刺激EA-hy926细胞24 h和浓度为4 μmol/L的Am80刺激EA-hy926细胞不同时点后，提取细胞总RNA，通过real-time PCR方法检测细胞周期抑制蛋白 P21和细胞周期蛋白cyclinB1以及MMP-2 mRNA的表达变化。结果显示，在Am80 浓度为 0～4 μmol/L范围内，P21 的mRNA表达水平呈剂量依赖性升高，而cyclinB1和MMP-2的mRNA表达水平呈剂量依赖性降低；P21的mRNA表达水平呈时间依赖性升高，而cyclinB1和MMP-2的mRNA表达水平呈时间依赖性降低。见图2。

3 Am80显著抑制血管新生内膜增生

大鼠球囊内皮剥脱后28 d的损伤组颈总动脉中的内膜明显增生，呈弥散性增厚，管腔变小，内膜与中膜的厚度比值(I/M比值)，明显高于对照组；Am80组新生内膜的增生程度和 I/M 比值明显小于模型组(P<0.05)。以上结果显示，Am80 可以明显抑制球囊损伤诱导的血管内增生，见图3。

Figure 2.The effects of Am80 on the cell cycles and the mRNA expression of P21, cyclinB1 and MMP-2 in EA-hy926 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group;#P<0.05vs0 h.

图2 Am80 阻滞血管内皮细胞细胞周期进程和抑制周期蛋白mRNA的表达

Figure 3.Inhibitory effects of Am80 on intimal hyperplasia of carotid arteries after balloon injury. I/M： intima/tunicae media. Mean±SD.n=6.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsinjuried group.

图3 Am80 抑制球囊损伤诱导的血管内膜增生

4 Am80抑制血管内膜中cyclinB1和 MMP-2蛋白的表达，促进P21蛋白的表达

免疫组化实验结果显示，与对照组比较，棕黄色颗粒光密度明显增强，球囊损伤组新生内膜中cyclinB1的蛋白表达明显增多；而Am80组中，cyclinB1的表达与损伤模型组比较明显减少。而且在Western blot的实验中发现，Am80可以抑制cyclinB1和MMP-2的表达，但促进P21蛋白的表达。提示Am80可以通过抑制cyclinB1的蛋白表达而促进P21的表达,进而抑制细胞周期，见图4。

Figure 4.The protein expression (n=6) of cyclinB1, MMP-2 and P21 in the carotid arteries on day 28 after balloon injury and immunohistochemistry staining (n=3) of cyclinB1 in the carotid arteries (×200). Mean±SD.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsinjuried group.

图4 各组中cyclinB1、MMP-2和P21的蛋白表达以及免疫组化实验结果

讨 论

血管内膜的异常增殖是许多血管增殖性疾病如高血压、动脉粥样硬化、经皮腔内冠状动脉成形术术后再狭窄、血管移植术后新生内膜形成等发生发展的重要的细胞病理学基础。血管内膜的异常增殖主要是血管内皮细胞和平滑肌细胞异常增生所致。所以，了解血管内皮细胞和平滑肌细胞异常增生的分子机制对防治血管增殖性疾病非常重要。

维甲酸衍生物Am80是RARα的特异性激动剂。研究表明，Am80通过RARα能诱导细胞的分化[9]，同时，Am80也可以不通过RARα而通过其它通路来诱导细胞的分化[2,10]。我们前期的研究也显示，Am80可通过促进KLF4与RARα的相互作用而阻止血管新生内膜形成。但是对Am80通过什么通路、如何抑制血管内皮细胞增殖的分子机制知之甚少。细胞的异常增生可导致多种疾病的发生，维持细胞数目的稳态需要维持增殖和凋亡平衡，而增殖和凋亡的作用均依赖于细胞周期。P21作为细胞周期的负调控因子,与细胞凋亡密切相关。P21是细胞周期蛋白激酶抑制因子，P21不仅可直接抑制细胞周期蛋白激酶的活化，而且还能与DNA聚合酶σ的辅助因子增殖细胞核抗原结合，直接抑制DNA合成[11-12]。新的研究表明，P21与CK2蛋白相互作用影响组蛋白去乙酰化酶2的乙酰化从而通过调控KLF4的乙酰化水平，进而抑制膀胱癌细胞的增殖[13]。而且在P21启动子的核心序列-150 bp内有GKLF家族结合的DNA序列，我们前期的研究已经证实，Am80可以促进核转录因子KLF4与RARα的相互作用从而抑制血管内膜的增生，从而我们推测，Am80也可能通过促进转录因子KLF4在P21启动子上与GKLF结合位点结合，从而促进P21的转录活性。在本研究中我们证实了Am80的抗增殖活性，而且也发现Am80可促进P21的表达，这可能是其阻滞细胞周期调控的机制之一。

CyclinB1是第1个被发现的细胞周期蛋白，研究表明，cyclinB1主要参与细胞周期检测点的调控，并维持基因组的稳定性[14]。而且在细胞周期进程中，cyclinB1的mRNA水平与蛋白水平呈平行变化，也就是说，细胞周期不同阶段的转录因子和转录调节蛋白可以结合于其启动子的不同区域，从而调控细胞周期不同时期的转换。而且研究表明，过表达cyclinB1能促进细胞周期中G2/M期的转换，甚至导致细胞增生的失控或者恶化[15-16]。本研究发现，给予内皮细胞Am80刺激后，cyclinB1的表达水平明显呈时间和浓度依赖方式下降，而且流式细胞术检测细胞周期分布时也发现，给予Am80刺激24 h后，细胞周期停滞在G2/S期，以上结果也表明了，Am80通过降低内皮细胞中cyclinB1的表达，从而影响了内皮细胞中G2/S期的转换，进而影响细胞的增殖。通过体内动物模型实验我们也证实了Am80可以通过降低血管内膜中cyclinB1的表达而抑制血管内膜的增生。MMP-2以无活性的酶原形式存在，一旦被激活后，可以水解许多细胞外基质成分，从而促进细胞的迁移。在本研究中，Am80刺激可抑制MMP-2的表达。

通过本研究，我们证实了Am80可以在正常血管内皮细胞中通过提高P21蛋白而抑制cyclinB1蛋白的表达，从而间接使内皮细胞的细胞周期停滞在G2/S期中，进而减少了内皮细胞数目的增多并抑制了球囊损伤造成的血管内膜的异常增殖。

[1] Uruno A, Noguchi N, Matsuda K, et al. All-transretinoic acid and a novel synthetic retinoid tamibarotene (Am80) differentially regulate CD38 expression in human leukemia HL-60 cells: possible involvement of protein kinase C-δ[J]. J Leukoc Biol, 2011, 90(2):235-247.

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(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

Inhibitory effects of Am80 on proliferation in vascular endothelial cells and neointima hyperplasia of carotid arteries

WANG Ying1, LÜ Xin-rui2

(1TheFirstAffiliatedHospital,2DepartmentofPhysiology,MedicalCollege,HenanUniversity,Kaifeng475004,China.E-mail:lvxinrui@126.com)

AIM: To explore the inhibitory effects of Am80 on the proliferation in the vascular endothelial cells (VECs) and neointima hyperplasia of the carotid arteries after balloon injury in the rats. METHODS: The proliferation of EA-hy926 cells were detected by cell counting and MTS assay after the cells were treated with various doses of Am80 for 24 h. The cell cycle was analyzed by flow cytometry after the cells were stained with PI. The mRNA expression of cyclinB1, P21 and matrix metalloproteinase (MMP)-2 in the EA-Hy926 cells was detected by real-time PCR. The changes of neointima hyperplasia in the carotid arteries were observed under microscope with hemotoxylin and eosin (HE) staining, and the expression of cyclinB1 was examined by the method of immunohistochemistry. RESULTS: The proliferation of EA-Hy926 cells was obviously inhibited in a dose-dependent manner when the cells were treated with various doses of Am80 for 24 h. The cell cycle was arrested at G2/S stage in response to Am80 treatment. The mRNA expression of P21 was increased, however, the mRNA expression of cyclinB1 and MMP-2 was decreased when the cells were treated with Am80 at 4 μmol/L for various times. In addition, thevivoexperiment demonstrated that Am80 not only significantly reduced neointimal hyperplasia and the thickness ratio of intima to tunicae media compared with injured group, but also inhibited cyclinB1 expression in the carotid arteries. CONCLUSION: Am80 inhibits the proliferation of VECs and neointima hyperplasia in the carotid arteries after balloon injury by promoting P21 expression and decreasing cyclinB1 expression.

Am80; Vascular endothelial cells; Neointima hyperplasia; Cell cycle

1000- 4718(2016)12- 2205- 06

2016- 08- 17

2016- 11- 03

国家自然科学基金资助项目(No. U1404310; No. 81600940)；河南大学博士启动基金(No. B2013043)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.12.013

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 0371-23880585； E-mail: lvxinrui@126.com