邓渊钰，孙海燕，李 伟，张爱香，陈怀谷

(江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏南京 210014)

小麦茎基腐镰孢菌致病力的快速测定

邓渊钰，孙海燕，李 伟，张爱香，陈怀谷

(江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏南京 210014)

为建立快速、简便测定小麦茎基腐镰孢菌致病力的方法，将5 mm的菌碟套接在催芽3 d的小麦胚芽基部，接种后的小麦置于垫有湿滤纸的培养皿中，25 ℃下光暗(12 h/12 h)交替培养5 d后测量麦苗的长度，以小麦苗长的降低率作为镰孢菌致病力的指标。结果发现，用该方法对12个菌株的致病力的测定结果与湿纸巾法有很强的相关性。经该方法测定，CF0915菌株的野生型和 Tri5基因敲除突变体的致病力有显著差异。

小麦茎基腐病；镰孢菌；致病力测定

小麦茎基腐病是由镰孢菌(Fusariumspp.)引起的除赤霉病之外的另一种重要小麦病害，该病害已对多个国家的小麦生产造成了严重的影响[1]。镰孢菌在小麦的茎基部开始侵染，并沿着茎向上扩展，使茎基向上的多个节和节间出现褐变，病变的组织尤其是根茎交界处出现干腐的症状。该病害发生部位低，在小麦生长早期不易被发现，但在小麦成熟期往往会导致枯白穗,造成直接的产量损失[2-3]，该病害还导致单端孢霉烯毒素在麦粒中积累,危害人和动物的健康[4-5]。20世纪小麦茎基腐病在我国仅有零星发生，但近年来已在我国的河南、河北、山东、安徽和江苏等小麦主产省的部分地区造成严重危害[6]。据我们实地考察，江苏沿海部分田块由小麦茎基腐病造成的枯白穗率超过30%。在世界范围内，引起小麦茎基腐病的病原菌有禾谷镰孢菌综合物种(F.graminearumcomplex)、假禾谷镰孢菌(F.pseudograminearum)和黄色镰孢菌(F.culmorum)等[7-9]。在我国，小麦茎基腐病的优势病原菌为禾谷镰孢菌综合物种中的禾谷镰孢菌(F.graminearum)和亚洲镰孢菌(F.asiaticum)[10]，假禾谷镰孢菌也有明显的上升趋势[11-12]。

病原菌致病力的测定对于病原的鉴定、病原菌的致病机理、病原菌与寄主的互作关系以及病害的防控等研究至关重要。目前针对小麦茎基腐病病原菌致病力的测定方法还未见报道。已有多种用于鉴定小麦品种对茎基腐病抗性的方法，这些方法也可用于病原菌致病力的测定[13-18]。但除了Yang等[18]的湿纸巾法可以在实验室内进行外，其他都需要在温室中以盆栽方式进行，不仅操作繁琐，工作量大，周期长，所需条件受季节影响也较大。本课题组在前期工作中，发现胚芽期小麦接种茎基腐镰孢菌后，生长受抑程度与所接病原菌的致病力直接相关。基于这一发现，本研究拟建立可在实验室进行的快速测定小麦茎基腐镰孢菌致病力的方法，以期为与小麦相关的镰孢菌的研究提供更多便利。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试菌株包括9株亚洲镰孢菌(Fusariumasiaticum)和3株禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)，均由本课题组于2009-2012年从小麦茎基腐病样品中分离所得，并经过形态学和分子生物学鉴定。其中CF0915菌株致病性较强，属于亚洲镰孢菌(F.asiaticum)，分离自江苏省南京市的小麦茎基腐病样品。CF0915菌株的 Tri5基因敲除突变体CF0915-Δtri和 Tri5基因回补突变体CF0915-Δtri+Tri由本实验室构建[19]。供试的小麦品种为扬麦158。

1.2 方 法

1.2.1 接种体的制备

菌碟的制备：将小麦茎基腐镰孢菌接种于PDA平板上，25 ℃黑暗培养6 d，在菌落边缘用打孔器制取直径为5 mm的菌碟。

孢子液的制备：将小麦茎基腐镰孢菌接种于6%的绿豆汤培养基中，25 ℃下震荡培养4 d, 在显微镜下用血球计数板测定其中的分生孢子数量，然后用无菌水将分生孢子稀释至1.0×106个·mL-1，接种前加入适量的吐温-20使其浓度为0.1%(v/v)[15]。

病麦粒的制备：将300 g小麦种子在水中浸泡4 h，沥干其表面的水分后分装至3个250 mL的三角瓶，灭菌；分别接入CF0915、CF0915-Δtri和CF0915-Δtri+Tri菌株，每个菌株接3个直径为5 mm的菌碟， 25 ℃培养，待麦粒上均匀地长满菌丝(28 d)后保存至4 ℃冰箱。

1.2.2 接种方式的比较

将小麦种子用1% NaClO溶液消毒后置于25 ℃下催芽3 d，挑选胚芽长度为1.2 cm左右的幼苗分别用以下3种方式接种，然后按1.2.3所述，在室温下(25 ℃左右)培养5 d，调查发病情况，选取发病程度最高的接种方式进行后续研究。

接种方式一(套菌碟)：在制备好的菌株CF0915的菌碟中央用200 μL的加样器吸头尖端扎一小孔，将小麦胚芽的尖端插入小孔并推动菌碟至胚芽的基部，使得每棵小麦的胚芽上套有一个菌碟并且菌碟的菌丝面与小麦的种子接触。

接种方式二(孢子液浸泡)：将小麦幼苗在菌株CF0915的孢子液中浸泡2 min后取出。

接种方式三(滴加孢子液)：将小麦幼苗先放置在培养皿中，在每棵幼苗的胚芽和种子的夹角处滴加10 μL菌株CF0915的孢子液。

1.2.3 小麦的培养和病菌致病力的测定

在9 cm培养皿中垫2层滤纸，滤纸上加5 mL无菌水使其湿润；在每个培养皿中均匀放置10棵已接种的小麦(套菌碟或孢子液浸泡)或放置小麦后接种(滴加孢子液)；盖上培养皿盖，置于25 ℃下光暗交替(14 h/10 h)培养，同时设不接种的对照。

培养5 d后，观察每个培养皿中小麦幼苗的生长和发病情况，测量小麦的苗长(茎基部至叶尖的长度)，每个培养皿中10棵小麦苗长的平均值为一次重复，共设4次重复。以生长抑制率作为病菌致病力的指标。生长抑制率=(对照小麦苗长-接菌小麦苗长)/(对照小麦苗长-接种时胚芽的长度)×100%。

1.2.4 培养温度的选择

小麦用1.2.2中发病程度最高的方式接种，分别于15、18、21、24、27和30 ℃下培养7 d，测量小麦的苗长，比较不同温度下病菌对小麦的生长抑制率。

1.2.5 培养时间的选择

小麦用1.2.4的方法接种，于25 ℃下分别培养3、4、5、6、7 d，测量小麦的苗长，比较培养不同时间病菌对小麦的生长抑制率。

1.2.6 本方法与湿纸巾法的比较

对随机选取的12个小麦茎基腐镰孢菌菌株，进行本试验最优条件和略作修改的湿纸巾法的致病力测定。湿纸巾法除了小麦幼苗的接种采用本文所述的套菌碟的方式外，其余的均参照杨学明的方法[18]。对两种方法所测结果进行Pearson相关性分析。

1.2.7 Tri5基因敲除和回补突变体致病力的测定

用本试验最优条件对CF0915的野生菌株(CF0915-WT)和CF0915的 Tri5基因敲除突变体(CF0915-Δtri)及其回补突变体(CF0915-Δtri+Tri)进行致病力测定，并将此测定结果与本课题组前期盆栽和小麦穗部接种的致病力测定结果[19-20]进行比较。

2 结果与分析

2.1 关键技术与条件的优化

2.1.1 接种方式

由图1可知，接种后5 d，用套菌碟方式接种的小麦幼苗的苗长显著低于对照，并有87.5%的幼苗出现茎基变褐的症状；用孢子液浸泡方式接种的小麦幼苗的生长也显著受到抑制，72.5%的幼苗茎基变褐；用滴加孢子液方式接种的小麦幼苗的苗长与对照差异不显著，但有30%的幼苗茎基变褐。套菌碟方式最利于小麦发病。

图柱上不同字母表示处理间差异显著(P<0.05) 。

Different letters above the columns indicate significant difference among different treatments (P<0.05).

图1 不同接种方式对小麦苗长的影响

Fig.1 Effect of different inoculation ways on length of wheat seedling

图柱上不同字母表示接种与不接种处理间差异显著(P<0.05)。图3同。

Different letters above the columns indicate significant difference between inoculated and uninoculated(P<0.05).The same as in Fig.3.

图2 不同培养温度对小麦幼苗长和生长抑制率的影响

Fig.2 Effect of different temperatures on length of wheat seedling and growth inhibition ratio

2.1.2 培养温度

由图2可知，小麦培养7 d后，幼苗在24 ℃时最高，说明此温度最适合小麦生长。用套菌碟的方式接种，在15～27 ℃的范围内，随着温度的升高，病菌对幼苗的生长抑制率显著增强，27 ℃时达最高(42.5%)。当温度升至30 ℃时，病菌对小麦幼苗的生长抑制率则明显减弱，说明27 ℃时病菌的致病力最强。综合幼苗的生长和病菌致病力，24～27 ℃为最适温度。

2.1.3 培养时间

用套菌碟的方式接种，25 ℃培养，2～3 d后即能观察到小麦幼苗的生长受到抑制，并有少数幼苗出现茎基变褐的症状。随着时间推移，小麦生长受抑程度加重，茎基变褐幼苗增加。由图3可知，接种后4～6 d间，小麦幼苗的生长抑制率增幅较大；接种6 d以后，生长抑制率仍有所增加，但增幅明显降低。用套菌碟的方式接种，在25 ℃下培养5 d即可鉴定病菌的致病效果。

2.2 两种方法对小麦茎基腐镰孢菌致病力的测定结果

由本研究方法和湿纸巾法对12个菌株致病力的测定结果(表1)可知，两种方法的Pearson相关系数为0.826 4，P值为0.000 9，说明两种方法所得结果有较好的一致性。

图3 不同培养时间对小麦幼苗长及生长抑制率的影响

Table 1 Virulence of twelve isolates assessed by two methods

菌株Isolate本方法Thismethod湿纸巾法Wet-towelmethod小麦的生长抑制率Growthinhibitionratioofwheat/%小麦的病情指数DiseaseindexofwheatCF090188.6498.75CF091540.6374.58CF092725.0457.08CF093044.0151.79CF093863.4375.00CF094060.3966.67CF094711.8131.51CF094935.4369.95CF097436.5557.24CF097916.6461.25CF110635.5951.61CF112125.0746.25

2.3 CF0915菌株 Tri5基因敲除和回补突变体的致病力

经本方法测定，CF0915菌株的 Tri5基因敲除突变体的致病力显著低于野生型，而其 Tri5基因回补突变体的致病力则有较大程度的恢复，与野生型差异不显著。这与盆栽试验和穗部接种试验的结果一致(表2)。

3 讨 论

本研究以小麦茎基腐镰孢菌能抑制胚芽期小麦的生长为依据，建立了新的小麦茎基腐镰孢菌致病力测定方法。与已报道的小麦茎基腐病菌致病力的测定方法相比，本方法具有快速简便的优点。传统的方法(盆栽法)所需的包括场地、温度和湿度等条件不易得到满足，并且需要对培养基质进行灭菌、装填等操作。本方法为室内试验，试验材料的培养在培养皿中进行，占用空间小，无需用培养基质，全程条件可控。盆栽法与湿纸巾法以小麦的病情指数作为镰孢菌致病力的指标，病情指数由病情分级计算而得，而病情分级的判断受主观影响较大。本方法所用的生长抑制率虽然是一种间接的指标，但其数据的获得更加直接和客观。盆栽法的试验周期通常为35～60 d，湿纸巾法的试验周期为15 d，而本方法在最优条件下的试验周期仅为5 d。本方法的可靠性已通过与湿纸巾法的测定结果比较得到验证。除了致病力测定外，本方法也可为研究有关基因在致病过程中的作用提供便利，如本课题组先前通过盆栽试验和小麦穗部接种试验证明了 Tri5基因对镰孢菌致病力的贡献，用本方法也得到了相同的结果。

表2 CF0915的 Tri5基因敲除和回补突变体的致病力

Table 2 Virulence of Tri5-deletion and complemented mutants of CF0915

菌株Strain本方法Thismethod盆栽试验Potexperiment穗部接种试验Headinoculationexperiment小麦的生长抑制率Growthinhibitionratioofwheat/%小麦的病情指数Diseaseindexofwheat病小穗数*Numberofdiseasedspikelets*CF091538.58a74.72a14.53aCF0915-Δtri8.76b35.57b2.37bCF0915-Δtri+Tri31.88a71.40a10.90a

同列数据后不同字母表示差异显著(P<0.05)；*:接种后28 d测定。

Different letters following dates in the same column mean significant difference(P<0.05);*:Tested at 28th day after inoculation.

套菌碟的接种方式具有一定的新颖性，它利用小麦胚芽的形态特点，将菌碟固定在小麦的茎基部，使菌丝与培养基和寄主植物同时接触，这种接种方式不仅实现了病原菌对寄主的快速和持续侵染，还可以为研究营养和相关环境条件对病原菌致病力的影响提供手段。浸泡孢子液的接种方式虽然使小麦致病的效率不如套菌碟高，但适当延长小麦接种后的培养时间，对病原菌致病力的测定也能得到良好的结果，由于其操作相对简单，较适合于对大批量菌株的测定。

虽然本方法对小麦茎基腐镰孢菌致病力的测定具有优势，但是由于其历时较短，小麦接种后主要表现为生长受到抑制，而不同品种之间的其他症状的差异还不能充分表现，所以在对小麦品种对茎基腐病的抗性鉴定方面，本方法不如盆栽法准确。

通过本方法对多个菌株的测定，发现不同菌株之间致病力有很大的差异，大多数菌株对小麦的生长抑制率为25～50%，少数菌株对小麦的生长抑制率在25%以下或50%以上，因此在利用本方法进行致病力测定时，建议将对小麦的生长抑制率低于25%的评为弱致病力菌株，生长抑制率为25～50%的评为中等致病力菌株，生长抑制率高于50%的评为强致病力菌株，同时可以选用致病力中等的菌株作为参照。

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Rapid Virulence Assessment ofFusariumPathogens Causing Crown Rot of Wheat

DENG Yuanyu,SUN Haiyan,LI Wei,ZHANG Aixiang,CHEN Huaigu

(Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing, Jiangsu 210014, China)

A simple and rapid method for virulence assessment ofFusariumspp. causing crown rot of wheat was established.Three-day old wheat seedling was inoculated with the pathogen by inserting the whole germ through the center of a 5-mm mycelial plug; inoculated seedlings were put onto a Petri dish matted with water-saturated filter papers and cultivated at 25 ℃ with alternation of light and dark(12 h/12 h) for 5 d; the shoot length of each seedling was measured, and the reduction rate of wheat shoot length was taken as the indicator of pathogen virulence. Result showed that the virulence of twelve isolates assessed by this new method has strong relationship with that assessed by the method of wet-towel. Assessed by this new method, the virulence of wide type and Tri5-deletion mutant of isolate CF0915 showed significant difference.

Crown rot of wheat；Fusariumspp.；Virulence assessment

时间：2016-11-04

2016-03-09

2016-04-20

国家小麦产业技术体系项目(CARS-3-1-17); 国家公益性行业(农业)专项(201503112)

E-mail：dengyy100@qq.com

陈怀谷(E-mail:huaigu@jaas.ac.cn)

S512.1；S435

A

1009-1041(2016)11-1547-06

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20161104.0926.038.html