王晔茹，宋筱瑜，高 芃，徐海滨，李 宁，朱江辉

(国家食品安全风险评估中心 卫生部食品安全风险评估重点实验室，北京100022)

凝结芽孢杆菌GBI-30,6086的安全性探讨

王晔茹，宋筱瑜，高 芃，徐海滨，李 宁，朱江辉

(国家食品安全风险评估中心 卫生部食品安全风险评估重点实验室，北京100022)

对凝结芽孢杆菌GBI-30,6086的食用安全性进行探讨。根据凝结芽孢杆菌GBI-30,6086的毒理学、耐药性和产毒能力、食用和使用情况等数据，考虑其推荐使用量和我国人群的消费水平，对其食用健康风险进行安全性评估。已有研究未观察到凝结芽孢杆菌GBI-30,6086具有毒性、耐药性和产毒能力，临床实验未见不良临床反应报告。将中国2002年居民的食物摄入量转换为食物摄取份数(25.38份)，凝结芽孢杆菌GBI-30,6086在其推荐剂量下，预估摄入量为5.1×1010CFU/d，小于每日可接受摄入量(ADI)值(8.0×1010CFU/d)。在其推荐剂量下，凝结芽孢杆菌GBI-30,6086对健康产生潜在影响的风险较低。

凝结芽孢杆菌；安全性评估；膳食暴露评估

凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)，革兰氏阳性菌，分类学上属于硬壁菌门,芽孢杆菌属。其细胞呈杆状，端生芽孢，无鞭毛,能分解糖类生成L-乳酸。凝结芽孢杆菌具有耐高温、耐酸和耐胆盐等特点，能够改善肠道菌群结构，调节肠道功能紊乱和维持肠道内菌群平衡，具有促进营养物质代谢和利用的功能[1-4]。凝结芽孢杆菌GBI-30,6086菌株是Ganeden生化科技筛选出的[5]。本研究以毒理学、耐药性、产毒能力、食用和使用情况等为基础，考虑其推荐使用量和我国人群的消费水平，对凝结芽孢杆菌GBI-30,6086菌株的健康风险进行安全性评价，以期为该物质的安全使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源

本研究的数据主要来源于PUBMED和中国知网的文献检索，部分数据为内部交流获得数据(尚未发表)。笔者获得文献后，对其中的不同信息分别做汇总分析。

1.2 评估方法

本次评估采用化学物评估的思路[6]，使用每日可接受摄入量值(acceptable daily intake，ADI)和每日预估摄入量值(estimated daily intake，EDI)作为评价指标。ADI值是无毒性量除以安全系数。无毒性量包括未观察到有害作用剂量(no observed adverse effect level,NOAEL)和未观察到作用剂量(no observed effect level,NOEL)。NOAEL和NOEL通常由动物实验数据推导获得。考虑人和实验动物的差异，不确定系数(uncertainty factor，UF)通常使用100。根据为期一年的慢性经口毒性研究和生殖毒性研究[7]，确定了凝结芽孢杆菌GBI-30,6086未观察到作用剂量(NOEL)的值，并以参考文献[6]的方法计算得到其ADI为9.4×1010CFU。具体计算见式(1)。

ADI=NOAEL(NOEL)/UF=

(6.88×1010×1.948×70)/100=9.4×1010CFU

(1)

式中：6.88×1010为每克饲料添加6.88×1010CFU的凝结芽孢杆菌数量；1.948为实验动物每天每千克体质量的进食饲料量；70 kg为美国一般人群标准体质量。

根据《美国农业部(USDA)营养学指南》[8]中6个主要的食品种类(谷物、水果、蔬菜、奶制品、肉类和其他类(其他类包括脂肪、油类和糖))不同消费人群每天平均进食份数(每一个性别/年龄组自我估计消费份数、实际消费份数和建议消费份数)，51岁及以上的男性每天所摄入的食物量最多，每天可摄入18.2份的食物，包括谷物、水果、蔬菜、牛奶、肉类和其他(脂肪、油类和糖类)。根据对食品工业调查，凝结芽孢杆菌GBI-30,6086在食品中的添加量为每份1.0×108～2.0×109CFU。本研究中的膳食摄入量数据采用中国居民营养与健康状况调查数据[9]，参考美国人群消费份数的思路[7]，将中国居民营养与健康状况调查数据转换成对应的消费份数，进而估算中国居民的预估摄入量。

1.3 专家判断法

在研究过程中，挑选本领域专业知识储备强、经验丰富的专家，对估计的数据征求意见，经过多次讨论，形成一致的意见。

2 结果与讨论

2.1 基本信息

凝结芽孢杆菌常用MRS培养基(乳酸细菌培养基)作为分离培养基。通常从形态、生理生化指标、代谢特征和16S rDNA 等方面进行鉴定[10-12]。凝结芽孢杆菌的标准菌株是美国菌种保藏中心(ATCC)7050。凝结芽孢杆菌GBI-30,6086的基因组序列已可在NCBI上检索[13]。凝结芽孢杆菌GBI-30,6086属于无毒级且无致病性，无遗传毒性，无生殖毒性。在亚慢性和慢性毒性试验中，未观察到与受试物相关的毒性表现[7,14]。

采用ISO/IDIS 10932 IDF 223抗生素抗药性(稀释法)(MISC_4021:2)方法对凝结芽孢杆菌GBI-30,6086进行耐药性试验。具体完成凝结芽孢杆菌GBI-30,6086菌株对氨苄西林、氯霉素、环丙沙星、克林霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素、利奈唑烷、新霉素、利福平、链霉素、四环素、甲氧苄氨嘧啶、万古霉素和维及霉素等15种抗生素的敏感性测试。结果显示：凝结芽孢杆菌GBI-30,6086除对卡那霉素和链霉素耐受外，对其余13种抗生素敏感,最小抑菌质量浓度(mg/L)分别为氨苄西林0.125、氯霉素0.25、环丙沙星0.03、克林霉素0.125、红霉素0.125、庆大霉素0.031、利奈唑烷0.06、新霉素2.0、利福平0.016、四环素0.25、甲氧苄氨嘧啶0.063、万古霉素0.063和维及霉素0.016；而卡那霉素和链霉素均大于1 500 mg/L。这是因为卡那霉素和链霉素都属于氨基糖苷类抗生素，主要对革兰氏阴性杆菌有效，对革兰氏阳性菌的作用不强。菌株耐药性的产生可以由所使用抗生素的选择作用而产生，也可以由具有耐药性的细菌转导产生。关于天然具有抗生素耐药性的双歧杆菌和乳酸杆菌已有报道。目前，多种食品用乳酸杆菌、双歧杆菌及链球菌均有部分耐药性[15],此类细菌多是动物和人类长期历史进化过程中形成的正常微生物群落。目前，由凝结芽孢杆菌耐药性所导致的危害还未见报道。凝结芽孢杆菌制剂耐药性风险低。

凝结芽孢杆菌GBI-30,6086菌株肠毒素基因PCR鉴定结果为阴性。以凝结芽孢杆菌GBI-30基因作为PCR目标序列，使用2种溶血素BL促细胞溶解物质以及3种非溶血肠毒素进行试验，结果并没有预期大小的PCR扩增。对于溶血型BL和非溶血型肠毒素，实验结果呈阴性。有研究报道表明，部分芽孢杆菌可能产生溶血素，如枯草芽孢杆菌的部分代谢物能够引起溶血[16-17]。菌株的致病性与其溶血活力密切相关，因此溶血素被作为致病的重要毒力因子。凝结芽孢杆菌GBI-30,6086菌株肠毒素基因PCR鉴定结果为阴性，提示其致病性较低。

2.2 人群资料

有文献报道针对凝结芽孢杆菌GBI-30,6086菌株的功能而开展的相关人群研究，所提供的研究并未报道任何不良临床症状,相关数据见表1。

表1 凝结芽孢杆菌GBI-30,6086菌株的人群研究资料Table 1 Population research data ofBacillus coagulans GBI-30,6086

2.3 食用和使用资料

近年来，凝结芽孢杆菌作为微生态制剂被广泛地应用于畜牧、水产、医药、保健和食品等行业[24-29]。2010年，青岛东海药业有限公司的“凝结芽孢杆菌活菌片”(商品名为“爽舒宝”)获得国家食品药品监督管理总局的国产药品批准文号(国药准字S20050032)，规格为“每片350 mg,含凝结芽孢杆菌活菌数不低于5.0×107CFU/g”。爽舒宝的作用是调节肠道菌群等。爽舒宝的禁忌证标示为“对微生态制剂有过敏史者禁用”。

凝结芽孢杆菌作为人和动物用益生菌，被列入国际乳业联盟《具有在食品中的使用历史的微生物名单》，同时国际乳业联盟关于《食品发酵：工艺用微生物》中记录，凝结芽孢杆菌ATCC7050在食品中的应用可追溯至1915年[30-31]。2007年，凝结芽孢杆菌获得欧洲食品安全局(european food safety authority,EFSA)安全资格认定(qualified presumption of safety,QPS)，并于2011年被列入QPS推荐生物制剂列表中[32]。美国食品药品管理局2011年通报凝结芽孢杆菌GBI-30,6086为公认安全物质(generally recognized as safe,GRAS)，可作为食品配料用在多种食品类别中，在食品中添加量大约为 2.0×109CFU/份。加拿大卫生部2011年通报，凝结芽孢杆菌GBI-30,6086允许在加拿大销售。澳大利亚和新西兰食品局于2008年通报，凝结芽孢杆菌GBI-30,6086允许在澳、新销售。凝结芽孢杆菌GBI-30,6086已经用在多种食品中，如营养补充剂、休闲食品、饮料、即食谷物等。

2.4 摄入量评估

美国每天最多食物消费人群摄取份数是18.2份，假设每份食物中的凝结芽孢杆菌添加量均为最高值2.0×109CFU，得出美国人群每日预估摄入量(EDI)为3.6×1010CFU。

采用美国计算份数评估的思路，参考凝结芽孢杆菌GBI-30,6086未观察到作用剂量(NOEL)的值[7]，结合中国人体质量平均值(60 kg)，计算得到中国人每日可接受摄入量ADI为8.0×1010CFU，具体计算见式(2)。

ADI=NOAEL(NOEL)/UF=

(6.88×1010×1.948×60)/100=8.0×1010CFU

(2)

参考《2002年中国居民营养与健康状况调查报告》[9]，将中国居民消费谷物、水果、蔬菜、奶制品、肉类和其他类转换为对应的份数。除“其他类”缺乏数据外，谷物、水果、蔬菜、奶制品、肉类等5大类食物，中国居民平均消费20.88份(表2)。其中，2002年全国城乡居民的食物摄入量中谷物消费量是将中国居民每日消费米及其制品、面及其制品、其他谷类和薯类的平均值进行加和，是对中国居民消费谷物的保守估计(高估)。假设中国人“其他类”的消费量和美国人消费量相同，为4.5份，得出中国居民平均食物消费人群摄取份数(25.38份)。假设每份食物中的凝结芽孢杆菌添加量均为最高值2.0×109CFU，得出中国居民每日预估摄入量(EDI)为5.1×1010CFU，预估摄入量小于ADI。

表2 中国和美国居民食物实际消费数据[8-9]Table 2 Chinese and American food consumption data

注：中国居民2002年全国城乡居民的食物摄入量谷物消费量(451.2 g)=米及其制品(239.9 g)+面及其制品(138.5 g)+其他谷类(23.3 g)+薯类(49.5 g)；肉类消费量(109.6 g)=畜禽类(79.5 g)+鱼虾类(30.1 g)。

3 结论

以凝结芽孢杆菌GBI-30,6086菌株的基本信息、毒理学、耐药性、产毒能力、食用和使用情况等资料为基础，本研究主要考虑其推荐使用量和我国人群的消费水平，对该菌株的健康风险开展安全性评价。

与污染物的危害评估类似，食品工业用菌的安全性评价也应当重视用本国数据进行暴露评估，因为各国食物种类、饮食习惯和膳食结构都不相同。本研究基于文献针对凝结芽孢杆菌GBI-30,6086菌株开展安全性评估的方法，将中国2002年全国城乡居民的食物摄入量数据转换为食物摄取份数(25.38份)，凝结芽孢杆菌GBI-30,6086菌株在其推荐剂量下，预估摄入量为5.1×1010CFU/d，小于ADI值。凝结芽孢杆菌已列入IDF名单，欧盟QPS推荐生物制剂列表，凝结芽孢杆菌GBI-30,6086已通过美国GRAS认定，在加拿大、澳大利亚和新西兰等多个国家作为普通食品管理，在市场销售多年。根据凝结芽孢杆菌GBI-30,6086的安全性资料和评价结果，认为在其推荐剂量下作为食品成分应用于食品中的健康风险较低。

本研究结果存在一定的不确定性。一是本研究数据是基于现有可获得的资料。人群消费量数据采用2002年中国居民营养与健康状况调查报告，与现阶段人群消费模式可能存在差异。二是食物消费量数据份数折算的方法借鉴了美国膳食指南和专家判断法，存在一定的不确定性。

食品工业用菌的安全是食品安全的重要部分。目前我国的食品工业用菌涵盖的菌种数量和种类与欧美等发达国家还有较大差距。与欧美国家完善的食品工业用菌安全评估程序相比，我国急需建立食品工业用菌风险评估导则。

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(责任编辑 管珺)

Safety of Bacillus coagulans GBI-30,6086

WANG Yeru,SONG Xiaoyu,GAO Peng,XU Haibin,LI Ning,ZHU Jianghui

(Key Laboratory of Food Safety Risk Assessment of Ministry of Health,China National Center for Food Safety Risk Assessment,Beijing 100022,China)

The food safety ofBacilluscoagulansGBI-30,6086 was discussed. According to the toxicology,drug resistance,toxin production capacity ofBacilluscoagulansGBI-30,6086,the safety risk was evaluated with the Chinese residents’ recommended and the consumption data. There were no reports concerning the toxicity,drug resistance,toxin production capacity and adverse clinical reaction ofBacilluscoagulansGBI-30,6086. Converted the Chinese consumption data to food servings(25.38),the consumption ofBacilluscoagulansGBI-30,6086 was estimated to be 5.1×1010CFU per day under its recommendation,less than the ADI value(8.0×1010CFU/d).According to the evaluation results,the potential health effects caused byBacilluscoagulansGBI-30,6086 is of very low risk level.

Bacilluscoagulans; safety assessment; dietary exposure assessment

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.06.002

2016-03-03

国家食品安全风险评估中心高层次人才队伍建设项目(“523”项目)

王晔茹(1983—)，女，山西长治人，博士，研究方向：微生物风险评估；朱江辉(联系人)，副研究员，E-mail:zhujianghui@cfsa.net.cn

TS207.4

A

1672-3678(2016)06-0007-05